摘要：CRISPR/Cas9基因编辑系统目前已经广泛地应用于大肠杆菌工程菌株的构建,若能构建出一种能连续进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统,将极大地提高大肠杆菌工程菌株构建的效率。设计并构建了具有自剪切功能的供体质粒pV4,优化了双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现了基因的连续敲除或整合。pV4质粒,在原始供体质粒placZ的骨架区域添加3个元件:针对供体质粒上氯霉素基因cat的N20-gRNA序列;Ptrc启动子,用于表达cat-N20-gRNA;lacI^q序列,用于表达LacI蛋白调控Ptrc启动子。pV4供体系列质粒(敲除或整合)实现基因编辑后,cat-N20-gRNA在IPTG的诱导表达引导Cas9蛋白对供体质粒进行自剪切,从而方便下一轮基因的编辑。将pV4系列质粒(敲除或整合)应用于产衣康酸工程菌株的构建,连续敲除ptsI、iclR及整合cad基因,基因编辑结果显示,优化后的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,能快速消除供体质粒,实现基因的连续敲除或整合,节约了基因操作的时间,有广泛的工程菌株构建应用前景。