摘要：【目的】建立更高效的伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)靶基因敲除方法,敲除丝氨酸蛋白酶编码基因(cp40),并评价其在Cp感染致病中的作用。【方法】以p ECXK99E为载体,Cp宣汉株(XH02)cp40为靶基因,设计含CRISPR/Cas9的间隔序列(spacer)、导向RNA(guide RNA,g RNA)和cp40上下游同源臂的表达质粒(p EC-cp40g RNA-HDarm),转入含p Cas9g RNA-ccd B的Cp感受态细胞,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统以敲除cp40基因。通过比较cp40敲除株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对J774A.1巨噬细胞活力及白细胞介素(interleukin,IL)-1β分泌,以及体内感染小鼠致死率及脏器载菌水平,研究cp40与该病原感染致病之间的关系。【结果】应用所建立的双质粒CRISPR/Cas9编辑系统成功获得XH02的cp40敲除株(XH02Δcp40)。与XH02相比,XH02Δcp40在菌落形态及生长曲线上无明显差异,但XH02Δcp40感染J774A.1巨噬细胞的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放(P=0.06)、碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色比例均降低(P<0.01),体内感染小鼠致死率下降50%,并且被感染小鼠肝脏和肾脏中Cp含量显著降低(P<0.001)。【结论】本研究所建立的CRISPR/Cas9编辑系统可较高效敲除Cp基因,证实cp40是该病原感染致病相关基因,为后续基于该基因研究Cp感染致病机制奠定基础。

摘要：致病性螺旋体的独特侵入、定植、播散和在宿主体内持续生存能力与其表面黏附素密切相关。螺旋体黏附素主要功能是介导其对宿主细胞外基质成分、细胞表面受体、宿主血清和细胞外液成分的黏附。螺旋体黏附素在免疫中的重要作用包括诱导保护性免疫、激活炎症反应,以及通过抗原变异和补体抵抗,导致螺旋体免疫逃逸和形成持久性感染。本文综述了梅毒螺旋体、问号钩端螺旋体和伯氏疏螺旋体的主要黏附素在致病和免疫中作用的研究进展,为深入了解螺旋体的致病机制和设计新型螺旋体疫苗提供依据。

摘要：本研究以具有高效除草活性的生防菌株燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)HY-041为研究对象,通过单因素与正交组合试验设计,筛选出了HY-041菌株的最适产孢基质及最优基质配方;通过对载体及助剂的筛选,进行了可湿性粉剂的初步研制,并测定了可湿性粉剂对杂草藜(Chenopodium album)、密花香薷(Elsholtzia densa)、猪殃殃(Galium spurium)的致病性。结果表明:HY-041菌株的最适产孢单一基质为麦麸;最适基质配方组合为麦秆糠18.3 g,麦麸18.3 g,菜籽饼0.8 g,玉米粉12.2 g;最适载体为硅藻土,稳定剂为白炭黑,分散剂为羧甲基纤维素钠,保护剂为腐殖酸。盆栽杂草致病性结果显示,HY-041可湿性粉剂对盆栽杂草致病性表现为猪殃殃(***)>藜(***)>密花香薷(***)。因此,本研究所制备的燕麦镰刀菌(***)HY-041可湿性粉剂,可作为有效控制猪殃殃(***)等杂草的生物制剂。

摘要：【背景】自2011年以来,猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)发生变异,经典的疫苗株已不能完全抵抗PRV变异株的感染,国内多个猪场出现伪狂犬病的暴发,PRV变异毒株开始在我国大规模流行。【目的】通过分离PRV流行变异毒株,并对其进行遗传进化和致病性分析,为PRV流行病学调查及疫苗研制提供实验数据。【方法】采集黑龙江某猪场感染PRV的脑组织病料,根据GenBank PRV gE和gB保守序列设计引物,进行PCR鉴定。通过对gE和gC基因进行序列测定和遗传进化分析。利用BHK-21细胞分离病毒,采用噬斑纯化方法对病毒进行纯化。通过电镜、间接免疫荧光对病毒进行鉴定,测定病毒生长曲线并进行致病性研究。【结果】经PCR和测序鉴定分离株为PRV流行株,将其命名为HLJ-01。遗传进化分析结果显示,该分离毒株与我国近几年分离的流行变异株位于同一分支;氨基酸序列分析结果显示,gE和gC存在国内流行变异株的特征序列,表明该分离毒株为流行变异株。生长曲线显示,分离株HLJ-01在感染48 h时滴度最高(108.5 TCID50/mL)。电镜观察结果显示,病毒颗粒直径约150 nm,呈球形,有囊膜,囊膜外有放射状纤突,呈现典型PRV病毒特征。动物感染实验结果显示,107.0 TCID50剂量感染组死亡率为100%;106.0 TCID50剂量感染组死亡率为80%;105.0 TCID50剂量感染组死亡率为60%。仔猪在接种病毒后均出现PRV感染的典型症状和病理变化,证实分离毒株对仔猪有较强致病力。【结论】分离获得一株猪伪狂犬病毒,经鉴定该分离株为流行变异株,而且具有较强的致病力,这为PRV流行病学分析及疫苗候选株的筛选奠定了基础。

摘要：为明确2株SVA广西分离株的生长特性以及与其他毒株的同源关系,进一步了解其致病性,以GX84/2020和GX94/2020为研究对象,参考GD05/2017(MH316116)毒株全基因组序列设计4对覆盖全长的引物,通过RT-PCR扩增、测序和拼接,得到GX84/2020(MW117128)和GX94/2020(MW117129)毒株的全长基因组序列后进行序列分析;并将其攻毒8~10周龄仔猪。结果表明:GX84/2020和GX94/2020毒株基因组全长7250bp,同源性分析显示这2个广西分离株与其他43株SVA毒株的同源性为93.2%~98.1%;系统发育分析表明GX84/2020和GX94/2020毒株与美国毒株SVA-OH2(KU058183)亲缘关系最近,同源性为98.1%。攻毒结果显示,部分仔猪出现口蹄部位水疱、跛行及体温升高等临床症状,整个过程未出现仔猪死亡。通过全基因组序列分析和动物试验,明确了GX84/2020和GX94/2020分离株的生长特性、与其他毒株的同源关系以及该毒株的致病性,为研发疫苗和抗病毒药物奠定了基础,且丰富了SVA的基因组信息数据库。

摘要：目的建立多重PCR体系,实现猪链球菌毒力相关因子基因cps、mrp、epf(epf*)和sly的同步检测。方法根据上述毒力因子基因核苷酸序列,设计和合成4对特异性引物,通过体系和条件优化,建立多重PCR检测方法,并对72株种属背景明确的实验菌株(其中猪链球菌48株、阴性对照株24株)及49株猪临床分离的链球菌样本进行检测分析。结果48株猪链球菌中,cps2检出率为33.3%(16/48)、mrp检出率为29.2%(14/48)、epf检出率为25%(12/48)、epf*检出率为6.3%(3/48)、sly检出率为54.2%(26/48),上述检测结果与菌株的毒力因子背景情况完全相符;24株阴性对照和49株猪临床分离样本毒力因子检测结果均为阴性。结论多重PCR可用于猪链球菌毒力相关因子CPS2、MRP、EF、Sly的基因检测,特异性和敏感性好,为该病快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术手段。

摘要：发掘维罗纳气单胞菌特异性更强的检测靶点和毒力相关基因靶点,建立能够检测致病性维罗纳气单胞菌的PCR检测方法。通过序列比对分析气单胞菌的16S rRNA基因序列,筛选对维罗纳气单胞菌特异的引物,用于检测种特异性,利用气单胞菌气溶素基因保守引物,检测菌株的致病性,并进行反应条件和反应体系的优化,灵敏度试验和特异性试验。发掘并设计的维罗纳气单胞菌16S rRNA特异性引物结合气单胞菌气溶素基因保守引物建立的检测方法,对12株气单胞菌和10株非气单胞菌的检测结果显示,所有致病性维罗纳气单胞菌都能扩增到大小分别为343 bp和232 bp的特异性条带,而非维罗纳气单胞菌的致病性气单胞菌只能扩增到232 bp的气溶素基因特异性条带,其它菌株都不能扩增到目的条带。灵敏度试验表明,该反应体系的检测灵敏度为1.35×10-3 mg/L。我们建立的致病性维罗纳气单胞菌检测方法能特异地检测致病性维罗纳气单胞菌,并具有高度灵敏性。

摘要：禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)是一种常见的禽肿瘤性病毒,可诱发感染鸡群免疫抑制,给我国养禽业带来巨大经济损失。本试验运用DF-1细胞接种方法,在山东省某父母代白羽肉种鸡场鸡群中分离到1株REV,将其命名为SD2101株。为掌握SD2101株基因组遗传演化特征,设计合成6对引物,通过PCR扩增获得了SD2101株的前病毒全基因组序列,并与GenBank下载的参考毒株进行了序列比对和遗传进化分析。结果显示:SD2101株前病毒全基因组具有典型复制完整型逆转录病毒的基因组结构,与2011年分离自江苏省的鸡源REV野毒株HA1101同源性最高;遗传进化分析发现,SD2101株与大部分国内分离株处于同一进化支上。为了解SD2101株的致病性,将分离毒株接种于1日龄SPF鸡,通过体质量、免疫器官指数和灭活疫苗免疫应答等指标进行评价。结果显示,SD2101株对1日龄SPF鸡的生长和免疫功能具有明显的抑制作用。综上,与参考毒株相比,SD2101株基因组序列变异程度较小,具有一定致病作用,提示在生产中应加强对REV的关注和监测。本研究为REV的流行病学研究提供了信息资料。

摘要：目的·运用隐性突变携带者重测序策略发现并归类耳聋致病基因罕见良性变异,为遗传性耳聋的高通量二代测序结果解读提供良性多态参考数据库。方法·在已明确隐性耳聋基因双等位基因致病突变的耳聋患者的正常听力亲属中进行相应突变筛查,发现单杂合致病突变的携带者。运用靶向捕获二代测序技术在这些携带者中对相应耳聋基因进行外显子重测序,对所发现的对侧等位基因变异进行非致病性推断。结果·共30位正常听力的耳聋病例亲属被明确为某一已知耳聋基因隐性致病突变的杂合携带者。通过相应基因的靶向二代测序,在对侧等位基因上共发现32个非同义变异,在隐性完全外显的遗传模式下可被归类为良性非致病变异。其中SLC26A4基因p.A434T变异、LOXHD1基因p.R266Q变异、MYO15A基因p.K96Q变异、GJB2基因p.T123N变异及CDH23基因p.V1299I变异,共5个罕见变异等位基因频率小于0.005,部分变异被Polyphen-2、PROVEAN、SIFT或Mutation Taster软件预测为致病突变,或被耳聋变异数据库或人类基因组突变数据库记载为致病突变。结论·运用隐性突变携带者重测序策略可有效纠正部分被误判为致病的罕见良性变异,提高二代测序在单基因隐性遗传病病因诊断中的准确性和有效性。

摘要：细菌在长期进化过程中形成了设计精巧的蛋白传输系统,运送与寄主互作过程中产生的各种与致病有关的毒性因子和效应子。目前已发现在细菌基因组中至少存在6种不同类型的分泌系统。本文着重介绍新近发现的Ⅵ型分泌系统及其与革兰氏阴性病原细菌致病性的关系。