摘要：目的建立可同时检测各型人微小病毒B19(HPV B19)的荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法。方法运用在线工具MAFFT比对分析3种基因型的HPV B19代表病毒株NS1区域序列,针对保守区序列设计特异性的引物和探针。建立检测HPV B19实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性和特异性进行评估。结果1×10^(7)~1×10^(2)拷贝/μL以及20拷贝/μL质粒DNA模板绘制的标准曲线,反应效率E为0.946,R^(2)值为0.9966;本方法的检测下限为10拷贝/μL,定量下限为20拷贝/μL。单纯疱疹病毒(HSV)2型、巨细胞病毒(CMV)、B族链球菌(GBS)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)的阳性DNA病毒检测结果均为阴性,参考质粒及HPV B19阳性样本正常扩增。结论建立的荧光定量PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,可运用于HPV B19感染的筛查和诊断。

摘要：为建立准确定量速冻面米制品中金黄色葡萄球菌活菌,筛查肠毒素sea基因并指示PCR反应假阴性的三重PMA-qPCR检测方法。针对金黄色葡萄球菌特异靶基因RpiR和肠毒素基因sea序列保守区,设计引物、探针和构建扩增内标,优化建立三重qPCR检测体系,建立PMA食品前处理方法去除死菌DNA,构建纯培养物和速冻面米制品中污染金黄色葡萄球菌的定量标准曲线,应用三重PMA-qPCR方法检测人工污染金黄色葡萄球菌的速冻面米制品。采用GB4789.10-2016中规定的选择平板计数法,评价三重PMA-qPCR方法的检测性能。结果表明,三重PMA-qPCR检测体系扩增效率高,特异性好。当食品中金黄色葡萄球菌污染量大于10^3CFU/g时,靶基因RpiR可获得有效扩增,污染量在10^3~10^7CFU/g之间时,扩增曲线线性良好(R^2=0.994),PMA-qPCR定量结果与平板计数结果一致性较好。当sea阳性菌株污染量大于10^3CFU/g时,应用PMA-qPCR方法可有效评估食品污染肠毒素A的风险。综上所述,本研究建立的三重PMA-qPCR检测方法操作简便,可快速定量检测速冻面米制品中金黄色葡萄球菌,评估食品污染肠毒素A的风险。

摘要：[目的]建立一种同时鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪支原体肺炎(Mhp)的检测方法,为PCV2、Hps和Mhp的净化提供技术支撑。[方法]针对PCV2的ORF2基因、Hps的tbpA基因、Mhp的p36基因保守序列,设计3对引物和TaqMan-MGB探针。人工合成包含了荧光PCR扩增目的基因在内的序列,并与载体连接,构建重组质粒PCV2-ORF2、Hps-tbpA、Mhp-p36,测序正确后作为标准质粒。条件优化后建立PCV2、Hps和Mhp的TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测方法。[结果]该方法具有良好的特异性,与其他常见猪病原不发生交叉反应。PCV2、Hps和Mhp敏感性最低检出量分别达到1.33×10、1.77×10、1.86×10 copies/μL。[结论]TaqMan-MGB多重荧光定量PCR检测法具有良好的敏感性、特异性、重复性,而且快速、准确。

摘要：根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列和金黄色葡萄球菌的nuc基因序列各设计一对引物和一条探针,建立基于TaqMan探针的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法。该方法对所有目标菌株均产生特异性扩增曲线,其他非目标菌均不产生扩增曲线,具有较强的特异性。且该法对阳性重组质粒pMD18-hlyA和pMD18-nuc同时定量扩增的敏感度分别为19.5拷贝/μL和18.7拷贝/μL。同步检测人工染菌肉样中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的最低检出限均为102CFU/g。

摘要：根据鸭线粒体基因组细胞色素b基因中的保守序列设计鸭特异性引物和TaqMan探针,建立肉制品中鸭源性成分定性和定量检测的荧光定量PCR技术。结果表明,引物与探针对于鸭源性成分的特异性良好,检测灵敏度达到1.78pg/反应,该方法可对鸭肌肉组织DNA进行准确定量。使用该技术对市售肉制品进行检测,发现大量使用鸭肉假冒的牛羊肉制品。本研究建立的鸭源性成分荧光定量PCR检测方法,为肉制品质量控制提供了有效的技术手段。

摘要：目的利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法根据布鲁氏菌特异性基因BCSP31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌(汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌O∶16、小肠结肠炎耶尔森菌O∶9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌)验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果应用多重Taq-Man荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL(13～24fg/μL),是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。

摘要：根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针。以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平。结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫。结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系。

摘要：目的了解FAKSiRNA对于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞中与瘢痕增生相关因子整合素α1、TGF-βR、黏着斑激酶(Focal adhesive kinase,FAK)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响,探索治疗增生性瘢痕的基因治疗方法。方法设计特异性探针合成FAKSiRNA片段,脂质体法转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,并用荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测、比较转染前后成纤维细胞内以上各因子的mRNA表达量的变化。结果转染48h后,FAKmRNA、整合素α1mRNA、TGF-βRmRNA、α-SMAmRNA的表达明显下降(P<0.05)。结论FAKSiRNA可能通过抑制增生性瘢痕成纤维细胞中整合素α1、TGF-βR、FAK和α-SMA的表达,从而抑制瘢痕的增生与挛缩。

摘要：目的结合随机扩增多态性技术(RAPD)和荧光定量聚合酶链式反应技术(qPCR)的优势,建立快速、准确地检测结核分枝杆菌的新方法。方法根据国内外文献设计随机引物,以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv为模板进行RAPD,产物进行琼脂糖凝胶电泳,选取条带进行割胶纯化测序,在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序上进行同源性检索,结果和结核分枝杆菌匹配率都达到99%。设计特异性内引物和探针,以RAPD产物为模板进行qPCR,并优化反应条件。分别以10倍梯度稀释的一系列浓度的H37Rv和其他阴性对照菌为模板,进行qPCR和RAPD-qPCR,分析其灵敏性和特异性。结果 qPCR能够检测到30pg/μl的结核分枝杆菌,而RAPD-qPCR灵敏性提高到3fg/μl。而且RAPD-qPCR检测30pg/μl至30fg/μl的结核分枝杆菌核酸时,扩增得到的Ct值都较小[(6.58±0.19)^(14.95±0.36)],结果稳定,易于判断。qPCR和RAPD-qPCR检测其他临床常见的细菌均呈现阴性。结论 RAPD-qPCR是一种快速、准确地检测出结核分枝杆菌的新方法。

摘要：目的分析转铁蛋白基因在致倦库蚊敏感品系、抗性种群体内的表达量。方法设计引物、提取RNA、扩增目的基因部分基因片段、纯化测序、序列比对、荧光定量PCR。采用t检验对敏感品系和抗性种群致倦库蚊体内转铁蛋白的基因表达量进行统计分析。结果扩增致倦库蚊转铁蛋白部分基因片段,测序后序列比对,荧光定量PCR分析显示,致倦库蚊敏感品系转铁蛋白荧光定量(T_(f敏))和抗性种群转铁蛋白荧光定量(T_(f抗))平均值分别为15.21和18.41,内参基因荧光定量(β_敏和β_抗)平均值分别为20.53和19.10,转铁蛋白基因在致倦库蚊抗性种群中的表达量降低,2个样本体内转铁蛋白基因表达差异有统计学意义(t=10.390,P<0.001)。结论致倦库蚊转铁蛋白基因可作为蚊虫抗性检测及治理的靶标基因。