摘要：目的建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×10^(2) cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(r^(2))均大于0.999。结论本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30 min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。

摘要：目的:建立检测ROS1融合基因的荧光PCR法,为肺癌病人的个体化药物治疗提供新的检测试剂盒。方法:根据人类ROS1基因的外显子和融合伙伴基因的外显子序列设计引物和探针,建立ROS1融合基因的荧光PCR法。然后采用不同ROS1基因融合的假病毒质粒作为质控品,评价方法的准确性、检测限和特异性。检测350例临床样本,并与直接测序结果进行比较,评价方法的临床适用性。结果:建立的ROS1融合基因PCR-荧光探针法,能准确检测出14种不同的ROS1融合基因;检测限是不高于总量0.01μg的RNA模板;正常人RNA的结果显示为融合突变阴性。临床样本的结果与测序结果的一致性好,Kappa值为1.00。结论:建立的ROS1融合基因检测方法具有很好的准确性、检测限和特异性,并且具有很好的临床适用性。

摘要：目的:建立检测CYP2C19基因多态性的PCR-荧光探针法,为预测CYP2C19代谢药物的疗效提供新的检测试剂盒。方法:应用Primer Express 3.0软件针对人类CYP2C19基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多态性位点设计引物和探针。以经测序确认为杂合突变型、纯合突变型或野生型的人类全血基因组DNA(genomic DNA,g DNA)样本为模板,应用荧光PCR法筛选合适的引物和探针,建立和优化CYP2C19基因多态性检测荧光PCR法。然后用特定浓度且基因型已知的人类全血g DNA样本作为质控品评价该方法的准确性、灵敏度和特异性。最后用100例临床样本验证该方法的临床适用性,并与直接测序结果进行比较,计算Kappa值。结果:建立的CYP2C19基因多态性检测PCR-荧光探针法,能准确地检测出CYP2C19*2、*3和*17多态性位点杂合突变型和纯合突变型;灵敏度为每个反应体系约1 ng;以基因型已知为野生型的全血g DNA为模板进行检测的结果显示均为野生型。临床样本的检测结果显示与测序结果的一致性较好,Kappa值为1.00。结论:建立的CYP2C19基因多态性检测方法具有很好的准确性、灵敏度和特异性,且具有很好的临床适用性,可以用于CYP2C19代谢的药物疗效的预测。

摘要：目的:建立检测鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因V600E突变的荧光聚合酶链式反应(PCR)方法,为黑色素瘤的药物靶向治疗提供新的基因检测方法。方法:根据BRAF基因序列V600E位点区域设计特异性的引物和探针,建立该检测方法。检测BRAF基因V600E突变的黑色素瘤临床样本、BRAF基因V600E突变质粒和正常临床样本,评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果:BRAF基因V600E突变的黑色素瘤临床样本在V600E检测体系中具有特异性的扩增;检测灵敏度约为101拷贝/反应;正常临床样本在V600E检测体系中没有特异性的扩增,均是V600E突变阴性。结论:建立的方法可以用于检测黑色素瘤临床样本中的BRAF基因V600E突变。

摘要：目的:建立一种可以检测高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的荧光PCR方法,为临床宫颈癌的筛查提供新的检测试剂盒。方法:选择高危型HPV的L1区基因序列作为靶序列,应用Primer Premier 5.0软件在选取的序列区域设计引物和探针,建立和优化该检测方法。通过评价其准确性、灵敏度和特异性,建立一种荧光PCR方法,用于高危型HPV基因分型的检测。结果:用HPV L1基因型质控品进行检测时,该试剂盒针对高危型HPV L1基因质控品均具有较好的阳性结果;检测灵敏度约为10～100拷贝.反应体系-1;低危型HPV L1基因质控品则为阴性结果,用正常人白细胞全基因组DNA进行检测时,没有HPV特异性扩增信号出现。结论:建立的高危型HPV基因分型荧光PCR检测方法具有良好的准确性、检测灵敏度和特异性,可以用于临床宫颈癌的筛查。

摘要：为提高活的非可培养状态空肠弯曲菌的检出率,建立了一种免疫磁珠捕获-荧光聚合酶链式反应法。该法包括应用免疫磁珠技术制备弯曲菌免疫磁珠,以直接捕获受检样品中的空肠弯曲菌,并设计了检测空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因的引物与荧光标记探针。结果表明:磁捕获-荧光聚合酶链式反应法可直接检测空肠弯曲菌,无需增菌培养,具有灵敏度高、选择性好、简便、快速等特点,可在24h内完成样品中活的非可培养状态空肠弯曲菌的检测。

摘要：目的建立检测人细胞色素氧化酶2C19(CYP2C19)基因多态性的荧光定量PCR检测方法。方法用Primer Premier5.0和Primer Express 3.0软件针对人CYP2C19基因681和636多态性位点分别设计1对引物和2条Taq Man-MGB探针,优化建立荧光PCR反应体系。评价该方法的准确性、灵敏度和重复性。用该方法检测300例临床样本,并用测序法进行验证。结果建立CYP2C19基因681和636位点荧光PCR检测方法,灵敏度为每个反应2 ng/g DNA。300例临床样本检测结果与测序法一致性为100%。结论建立的CYP2C19基因多态性荧光PCR检测法准确性较高、灵敏度和重复性较好,适于临床实验研究。