摘要：为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)核酸的荧光pcr方法,试验根据GenBank中ASFV的p72基因和PCV2的ORF1基因序列,分别设计特异性引物,通过对加样体系和扩增程序的优化,建立了检测ASFV和PCV2的双重SYBR GreenⅠ荧光pcr方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价,最后对收集的临床样品进行检测。结果表明,最终确立的20μL反应体系中各引物最佳添加量为:F10.7μL、R11.0μL、F20.8μL和R21.5μL;优化后的扩增反应程序为:95℃预变性3 min;94℃变性5 s,54℃退火20 s(此处收集荧光),40个循环。该方法具有很好的特异性,不与其他常见猪病原体发生交叉反应。检测ASFV和PCV2的灵敏度分别可达5.6 copies/μL和3.2 copies/μL,T_(m)值的批内和批间变异系数均不高于1.0%,对14份临床样品的检测结果与参比方法一致。本研究所建立ASFV和PCV的双重SYBR GreenⅠ荧光pcr方法敏感性高,特异性好,可用于临床2种疾病的快速检测。

摘要：为了对熊源性成分进行有效鉴定,本研究根据熊科动物线粒体DNA(mtDNA)序列,使用分子生物学软件Primer Express 3.0设计了一套特异性引物、探针,用以建立Taqman探针荧光pcr检测熊源性成分的方法。结果显示,所建立方法特异性强,15份熊属动物组织样品均出现特异性扩增曲线,20份阴性对照动物样品均未出现扩增曲线;方法灵敏度高,最低可以检测到10个拷贝数量级的重组质粒DNA,对熊胆粉稀释106倍后,仍可扩增出熊DNA;方法稳定性好,对相同的样品在不同时间进行2次重复检测,批内变异系数分别为0.88%、1.13%,批间变异系数为1.38%。结果表明,本研究建立的方法可应用于熊属动物组织及其加工品中的熊源性成分的检测。

摘要：根据转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (NOS)基因序列 ,设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针 ,建立一种应用荧光双链探针的实时pcr定量检测转基因成分 35S启动子和NOS终止子的方法。并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测 ,发现 11份样品中有 5份检出 35S和NOS基因成分 ,其余 6份样品结果为阴性。结果表明本文建立的荧光pcr方法能有效检测出 35S和NOS两种转基因成分 ,较常规pcr技术更为简便、快速、准确 ,有很好的应用前景和研究价值。

摘要：疯牛病是由于健康牛食入含有致病性朊粒的人工蛋白质饲料 (肉骨粉 )所致 ,而目前尚未见能有效、快速地检测饲料中牛、羊成分的技术报道。本文在前期研究〔1〕的基础上 ,运用荧光定量pcr法 ,针对牛、羊、鸡、猪几种不同动物的特异性基因序列设计了牛、羊两种动物的特异性探针 ,通过对整个pcr过程的实时荧光监测 ,来鉴定饲料中的牛、羊成分 ,并对其定量范围做了简单的讨论。本方法能有效解决普通pcr的样品污染问题 ,具有特异性强、灵敏度高。

摘要：目的:建立一种简便、特异的荧光定量pcr检测方法,用于金黄色葡萄球菌肠毒素的快速筛查检测。方法:按金黄色葡萄球菌肠毒素SEA～SEQ基因序列设计不同引物,在普通pcr检测体系中,加入SYBR Green I荧光染料,建立荧光pcr检测体系。对本课题组2006年-2009年分离的191株金葡菌进行SEA～SEQ基因检测。结果:荧光pcr法检测出金黄色葡萄球菌肠毒素阳性97株,阳性率为50.8%。肠毒素类型分布由高到低依次为A、C、B、D、E和G型。以ELISA方法作对照,荧光pcr检测法的灵敏度为100%,特异度为97.9%。结论:建立的荧光pcr检测金黄色葡萄球菌的肠毒素的方法可用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型,具有快速、敏感、特异性高的特点。

摘要：目的建立食物中毒样品中肉毒毒素基因的荧光pcr快速检测方法。方法对食物中毒臭豆腐样品进行前处理,直接从样品中提取基因组总DNA,对毒素基因保守区域设计特异性引物和探针,分别进行肉毒梭菌、A型、B型、E型和F型肉毒毒素基因的荧光pcr检测,FAM通道采集扩增荧光信号。结果食物中毒臭豆腐样品经过去蛋白和脂肪等前处理后,可直接提取获得食物基因组总DNA,以总DNA为模板同时进行肉毒梭菌及毒素基因的荧光pcr检测,检出含有A型、B型毒素基因,只有A型毒素基因表达的A(B)型肉毒梭菌。结论荧光pcr方法可快速检测食物中毒样品中的肉毒梭菌和毒素基因,对肉毒梭菌污染食品引起的食物中毒诊断具有参考价值。

摘要：目的:探讨荧光聚合酶链反应(pcr)在围生期孕妇B族链球菌(GBS)筛查中的应用价值及CAMP试验阴性GBS的鉴定分析。方法:收集产科门诊孕35~37周孕妇阴道/直肠拭子1143例,将拭子放入GBS增菌肉汤管增菌,分别用GBS显色平板和荧光pcr法检测GBS。16SrDNA分子鉴定技术对CAMP试验阴性GBS进行种属鉴定,并采用pcr技术检测其cfb基因。结果:显色平板检出146份阳性样本,阳性率为12.77%,荧光pcr法检出191份阳性样本,阳性率为16.71%,2种方法的阳性率差异有统计学意义(P<0.01);荧光pcr法与显色平板培养法相比,敏感性为93.15%、特异性为94.48%、符合率为94.31%。146株GBS中有10株为CAMP试验阴性,检出率为6.85%,均为cfb基因缺失株。结论:荧光pcr法可有效提高围生期孕妇GBS筛查的阳性率;该地区CAMP试验阴性GBS检出率较高,CAMP试验不宜作为GBS的鉴别试验,因存在缺失cfb基因GBS,GBS分子检测试剂不应选择该段基因设计引物。

摘要：目的建立单通道双重荧光pcr方法检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒,为探索超多重荧光pcr方法奠定基础。方法根据TOCE原理,首先在寨卡病毒的Taq Man探针荧光pcr技术基础上,设计两条含有不同标签序列的杂交探针,通过寨卡病毒毒株选择合适的标签序列,再根据合适的标签序列设计合成两条理论上解链温度不同的检测探针,同样用寨卡病毒毒株评估两条检测探针;接着按相同原则设计合成基孔肯雅病毒的杂交探针和检测探针,进行单管内单通道双重荧光pcr试验。结果标签序列的选择结果表明,只有当标签序列的解链温度低于荧光pcr的退火延伸温度时,阳性样本才能获得相应的扩增曲线;根据合适的标签序列设计合成的两条理论上解链温度不同的检测探针,实际检测时可以在同一检测通道中通过融解曲线分析准确区分。单管双重荧光pcr可准确检测出基孔肯雅病毒、寨卡病毒的毒株和阳性样本。结论建立了一种针对基孔肯雅病毒和寨卡病毒的单通道双重荧光pcr检测方法,为后续多种虫媒病毒超多重荧光pcr检测方法的开发提供借鉴。

摘要：应用荧光 pcr技术 ,利用 O型口蹄疫病毒 (FMDV)的 5′端 UTR区的 IRES片段设计和合成了可检测 7个血清型FMDV群特异性引物和 Taqman探针 ,建立了 1种敏感性高、特异性强、快速的检测方法 ,耗时仅为 4 h,克服了传统的病毒分离鉴定方法耗时长 ,敏感性和准确性较差 ,而且容易造成病毒扩散及环境污染的缺点 ,可广泛应用于动物的大批量、快速检疫。

摘要：利用鹿流行性出血病(EHD)病毒核酸的保守靶序列(VP7),设计引物和TaqMan荧光探针,建立了EHDV荧光定量RT-pcr技术,并进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价。结果显示,该技术可有效检出EHD-1、EHD-2、EHD-4、EHD-7型病毒,与蓝舌病病毒(BTV)等病毒无交叉反应;对阳性模板(重组质粒)的检测灵敏度为1个copies;重复检测CV<5%。因此,所建立的EHDV TaqMan/荧光定量RT-pcr方法可为鹿流行性出血病病毒检测提供一种快速、可靠的病原检测手段。