摘要：为建立饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分的广谱、快速检测方法,收集Genbank中鳕鱼、鲈鱼、沙丁鱼等鱼类,猪、牛、羊等哺乳类以及鸡、鸭、鹅等禽类的18S rRNA基因序列,分别设计特异性扩增引物和MGB-TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标物种类型而与其他物种无交叉反应。3套引物探针体系组合后可同时检测鱼类、哺乳类及禽类源性成分,三重荧光pcr方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的三重荧光pcr方法检测35份进境及国产饲料样本,从2份进口饲料及1份国产饲料中检出非标定动物源性成分,结果与行业标准方法的检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立的三重荧光pcr方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为包括饲料在内的动物产制品源性成分定性分析提供了新的技术分析手段。

摘要：目的建立检测人亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性荧光pcr的检测方法。方法用Primer Premier 5.0和Primer Express 3.0软件针对人MTHFR基因677多态性位点分别设计1对引物和2条TaqMan-MGB探针,通过GenBank在线比对分析评估引物的特异性,优化建立荧光pcr反应体系。以2个检测通道的循环阈值(Ct值)差值判断检测位点的基因型。评价该方法的最低检测限、准确度和精密度。用该方法检测300例临床样本,用核酸序列测定法对准确度进行评价。结果建立的荧光pcr法对MTHFR 677位点检测具有较高的准确度,最低检测限到达2 ng/反应。300例临床样本的检测结果与测序法的检测结果的一致性为100%。结论建立的MTHFR基因多态荧光pcr检测方法具有很好的准确度和精密度,适用于临床精准预测脑卒中发生风险和预后及指导孕妇个体化补充叶酸。

摘要：介绍了用于检测具有毒性质粒沙门菌的2种荧光pcr试剂盒(一种是荧光pcr染料法检测试剂盒,另一种是荧光pcr探针法检测试剂盒)的研制过程,2种试剂盒运用了自行设计的特异性引物和TaqMan探针,能同时特异性地从众多的沙门氏菌和非沙门氏菌中高效、快速、准确地检测出多种具有毒性质粒沙门氏菌,而对于不具有毒性质粒的沙门氏菌和非沙门氏菌均不能检出,可为食品检验和医疗诊断领域提供方便快捷检测具有毒素质粒沙门氏菌的荧光pcr试剂盒.

摘要：目的 建立一种能快速检测猴小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光pcr方法.方法 以小肠结肠炎耶尔森氏菌耐热肠毒素基因的保守区为靶区域设计特异引物和探针,建立一种能快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光pcr方法,并对方法的特异性、敏感性、线性相关性、重复性等因素进行试验.结果 建立的荧光pcr法对小肠结肠炎耶尔森氏菌具有特异的反应性,最低检出限为3.3×10 cfu/ml,菌液浓度在3.3×10〈＇7〉cfu/ml至3.3×10cfu/ml时与Ct值有较好的线性关系,试验重复性良好.结论 建立的小肠结肠炎耶尔森氏菌实时荧光pcr检测方法适用于猴小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测.

摘要：为构建一种灵敏、特异、准确的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)检测方法,以gyr B为靶基因设计特异性引物和探针,经过优化反应体系和退火温度,建立了迟缓爱德华氏菌荧光pcr方法。随后对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评估,并应用该方法进行临床样品检测。结果显示:当引物和探针浓度分别为250和200 nmol/L,退火温度为55℃时,建立的迟缓爱德华氏菌荧光pcr方法荧光曲线标准,线性关系良好,最低检测限可达12.4 CFU/m L,且1 CFU/m L的细菌经35℃培养1 h后即可被检出;与猪链球菌2型以及无乳链球菌等14种常见水生动物病原体无交叉反应;重复性试验变异系数均小于0.95%;在100份临床样品中,检出阳性22份,与细菌分离鉴定结果一致。结果表明,本研究建立的迟缓爱德华氏菌荧光pcr检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,为迟缓爱德华氏菌病的临床诊断和研究提供了技术支撑。

摘要：目的建立一种能同时检测空肠弯曲菌(CJ)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7、副溶血性弧菌(VP)和单核增生李斯特菌(LM)的多联实时荧光pcr定量方法。方法根据CJ的C基因序列、EHECO157:H7的RFBE基因序列、VP的toxR基因序列和LM的iap基因序列的开放阅读框(ORF),分别利用ABIprimerexperess2·0和DNAStar中的PrimerSelect软件设计出了数对特异性的引物和探针,筛选出最佳的各组引物和探针组合,对引物、探针的浓度、Mg2+浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,从而建立了检测临床标本中CJ、O157:H7、VP和LM的多联荧光pcr反应体系和检测方法。结果实验显示该方法具有特异性强,灵敏度高,均达到100copies/ml。结论多联实时荧光pcr方法可定量检测临床标本中CJ、O157:H7、VP和LM,该法快速简便,准确高效,有利于上述病原菌所致疾病的早期诊断和治疗。

摘要：目的建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应(荧光pcr)方法,并进行优化和评价。方法根据Ol群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因设计探针和引物,建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的荧光pcr方法,并对体系中的引物、Mg2+、dNTP和Taq酶进行优化,然后对建立的方法进行特异性、灵敏性、重复性的评价,并进行224份河口水样本的检测。结果建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重荧光pcr方法,对非O1群和O139群霍乱弧菌无扩增反应,敏感度比常规分离培养高。结论以O抗原编码基因为目标检测片段建立了O1群和O139群霍乱弧菌双重荧光pcr检测方法,可用于疑似霍乱弧菌感染的样本常规分离前的快速筛查。

摘要：目的建立一种高效、特异的荧光探针熔解曲线方法,用于鉴定16种金黄色葡萄球菌肠毒素。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素SEA～SEQ特异基因序列设计不同杂交连接探针,建立金黄色葡萄球菌肠毒素检测体系,评估其最低检出限、特异度、可重复性等指标。与普通pcr方法比较,采用荧光探针熔解曲线方法对本实验室的158株食物中毒金黄色葡萄球菌进行检测,评估新方法的灵敏度和特异度。结果荧光探针熔解曲线方法最低检出限为0.80～2.15 ng/μl,特异度为100.0%,无交叉荧光信号产生,变异系数<1%。与普通pcr方法比较,新方法的灵敏度为95.4%,特异度为100.0%,Kappa值为0.88。结论荧光探针熔解曲线技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法可覆盖金黄色葡萄球菌16种肠毒素,具有快速、准确、特异性高的特点。

摘要：目的建立一种能同时检测EV71型、CA16型及其它肠道病毒的荧光pcr检测方法,主要用于手足口病病原的快速检测。方法针对肠道病毒的保守基因设计特异性引物和探针序列,优化荧光RT-pcr反应体系,构建标准的阳性质控模板,建立标准曲线,研究产品的检测限、重复性、特异性;同时对2015年6月份收集的26份阳性样品和10份阴性样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒,线性范围在8×10~2 copies/μl^8×10~8 copies/μl范围内检测结果良好;优化后肠道病毒EVUN上下游引物和MGB探针浓度分别为0.50,0.50,0.30μmol/L,RT-pcr反应条件为:42℃30min,95℃3min;95℃5s,60℃35s,45个循环。检测限达到800copies/μl,变异系数CV≤5%,重复性好,特异性良好,与其他传染病毒无交叉反应;用该检测方法检测26份临床阳性样本和10份阴性样本,阳性检出率为100%(26/26),阴性检出率为100%(10/10)。结论试验所建立的荧光pcr检测方法,可用于临床对手足口病病原的快速检测。

摘要：[目的]建立双重荧光pcr法,检测动物产品中猪、牛源性成分。[方法]分别针对猪、牛线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)种间保守基因,设计特异性引物与探针,通过对反应体系和反应条件的优化筛选,建立了双重荧光pcr方法,在同一个荧光pcr反应中完成2种动物源性成分的检测,并对该方法的特异性、敏感性进行评估。[结果]对16种不同的动物DNA进行检测,仅猪、牛源性成分收集到相应的典型的S型扩增曲线,对猪、牛二联模板的检测,可同时收集到相应模板的扩增曲线,其余14种动物源性成分未发现扩增曲线。双重荧光pcr对猪肉、牛肉模板的最低检出限均为10-5,与相应的单重荧光pcr方法的检出限一致。[结论]该方法特异性强,敏感性高,适用于肉制品、奶制品、饲料等动物源性产品的检测。