摘要：目的 建立快速检测CYP2C19＊2和CYP2C19＊3 基因多态性的实验方法。方法 从样本库中选取100例血液样本。设计针对CYP2C19＊2和CYP2C19＊3基因多态性位点的特异性引物和taqman荧光探针,通过双管单色荧光pcr法检测基因型,与基因芯片法进行比较验证。结果 双管单色荧光pcr法能很好地鉴别CYP2C19＊2和CYP2C19＊3基因型,与基因芯片结果一致率为100%。结论 双管单色荧光pcr法能快速有效地进行CYP2C19＊2和CYP2C19＊3基因多态性分型,该方法期待用于临床实验室以指导个体化用药。

摘要：目的采用新型淬灭剂结合荧光pcr检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的检测方法。方法根据幽门螺杆菌23S r DNA第2142和2143两个基因多态性位点设计引物和标记新型荧光淬灭剂的探针;提取幽门螺杆菌菌体总DNA,采用实时荧光定量pcr方法对收集的55株幽门螺杆菌临床分离株进行检测,同时与Taq Man探针和直接测序方法结果进行比对,进一步评价其临床实用性。结果本试验建立的方法能特异性地甄别23S r DNA第2142和2143位点的基因多态性,除对应位点的探针出现荧光信号外,其他探针均为阴性。该方法的变异系数小于5%,样本灵敏度可达到1 copy/反应。对收集的55株幽门螺杆菌临床分离株进行检测,检测到AA型菌株36株(65.45%)、AG型菌株15株(27.27%)和GA型菌株4株(7.27%),与Taq Man探针及直接测序结果均一致。结论本试验所建立的方法能有效甄别幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变位点A2142G和A2143G。

摘要：目的建立改良分子信标-双重实时荧光pcr同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157:H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-双重实时pcr检测体系。结果双重荧光pcr反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157:H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光pcr阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157:H7实时荧光pcr阳性,其中26份大肠杆菌O157:H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h^1d。结论改良分子信标-多重实时荧光pcr检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

摘要：目的：设计一种弹回引物荧光pcr方法鉴定军团菌属和嗜肺军团菌。方法通过分析军团菌16S rRNA基因序列，采用生物信息学方法设计引物，优化实验条件，对方法的特异性、灵敏度进行评估，并对186株环境军团菌分离株与15份环境水样进行鉴定。结果经弹回引物检测，军团菌属菌株在85℃～86℃处有扩增子熔解峰，嗜肺军团菌在71℃处有探针结合区熔解峰，非军团菌未检测到熔解峰。弹回引物对标准菌株DNA与模拟水样灵敏度分别为1 ng／μl与（1×10^3～1×10^4）／ml。弹回引物对环境分离株验证实验中，成功鉴定了186株军团菌和44株嗜肺军团菌；对15份环境水样直接检测，检出12份军团菌属阳性水样与4份嗜肺军团菌阳性水样。结论弹回引物荧光pcr方法可用于军团菌属和嗜肺军团菌的鉴定，具有较高的特异性与灵敏度。

摘要：为了研究中药多糖增强免疫的作用和分子机理,用Primer Premier软件设计了1对白介素-4(IL-4)引物,1对干扰素-γ(IFN-γ)引物。从多糖辅助ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-pcr技术扩增出目的基因片段,并对其进行了酶切鉴定和测序。用荧光定量pcr方法测定黄芪多糖(APS)、板蓝根多糖(IRPS)、山药多糖(CYPS)、牛膝多糖(ARPS)4种多糖对鸡外周血T淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达的影响。结果表明,合适剂量的APS、IRPS、ARPS和CYPS均能提高淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达水平,并且APS、IRPS的效果优于ARPS、CYPS,这可能是多糖增强机体免疫的分子机制之一。

摘要：采用LUXTM新型荧光pcr技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物,建立了LUXTM荧光pcr和RT-pcr方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA。结果显示所建立的LUXTM荧光pcr/RT-pcr体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应。敏感性实验表明LUXTM荧光RT-pcr对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光pcr对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式pcr方法高104倍以上。采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品。

摘要：为建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的非洲猪瘟病毒(ASFV)检测方法,根据ASFV保守区域设计引物探针,在荧光pcr检测方法的基础上,建立了检测ASFV的微滴数字pcr方法,对其特异性及线性关系进行评估,以阴性样品和低拷贝样品分别测定该方法的空白检测限(LOB)和最低检测限(LOD)。结果显示:该方法有较好的线性关系(R2=0.999),与其他6种猪常见病毒及5种动物组织无交叉反应,LOB为1.6 copies/μL,LOD为3 copies/μL。利用建立的数字pcr、C1荧光pcr,以及世界动物卫生组织(WOAH)提供的荧光pcr和常规pcr方法对50份不同来源的样品进行检测,结果表明,建立的ASFV数字pcr检测方法具有高效、特异、灵敏等特点,可用于非洲猪瘟监测和口岸动物疫病防控。

摘要：裂谷热(RVF)具有较高的发病率与死亡率,极大危害着当地养殖业和生态系统的稳定。为建立一种能够快速有效检测裂谷热病毒(RVFV)的方法,本研究根据RVFV的保守序列设计了特异性引物与探针,分别建立了探针pcr和荧光pcr,并对这两种检测方法进行比较分析。结果显示,两种检测方法均不存在非特异扩增;最低检测浓度分别为1.03×10^(-2)拷贝/μL和1.03×10~0拷贝/μL,前者比后者有更高的灵敏度;探针pcr和荧光pcr组内和组间变异系数均小于3%。实验表明,探针pcr具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、准确度高、检测速度快等优点。因此,探针pcr是一种灵敏度和可靠性均较高的RVFV检测方法。

摘要：目的:研制一种基于双波长荧光pcr技术的乙型肝炎病毒DNA超敏定量检测试剂盒,并对其性能进行评价。方法:根据乙型肝炎病毒不同基因型中的保守序列设计特异性引物与TaqMan荧光探针,并设计非竞争性的外源性内参引物与探针,优化确定双波长荧光pcr反应体系和扩增条件;同时根据磁珠法原理,优化确定适合血清、血浆样本的病毒DNA高效提取方法,完成乙型肝炎病毒DNA超敏定量检测试剂盒的研制;最后测试本试剂盒的最低检出限、准确度、线性范围、精密度、基因型覆盖及特异性等性能指标,并完成166例临床样本的对比测试,评价试剂盒的临床应用性能。结果:自主研制的乙型肝炎病毒DNA超敏定量检测试剂盒最低检出限为5 IU/mL,线性范围为20~2.0×109 IU/mL,精密度CV值≤5%、覆盖型别包括A~H八种基因型,对常见的病原体检测无交叉反应。166例临床样本的对比检测结果表明,本试剂盒与已上市流通试剂盒的定性检测结果符合性良好,临床阳性符合率为98.67%(95%置信区间:95.27%,99.84%)、阴性符合率93.75%(95%置信区间:69.77%,99.84%)、总体符合率98.19%(95%置信区间:94.81%,99.63%);同时定量检测结果具有较高相关性(斜率0.99,相关系数|R|=0.982)。结论:自主研制试剂盒可实现乙型肝炎病毒DNA超敏精准定量检测,适合临床推广应用。

摘要：目的通过加入内参照DNA来监测反应体系中是否存在抑制物及其对沙眼衣原体检测结果的影响。方法采用荧光pcr技术和在原有反应体系中设计加入一段内参探针共同扩增,用两种方法对256例分泌物标本进行检测分析。结果在使用方法1的A组中有27例的受检标本检测出沙眼衣原体,阳性率为10.5%。使用方法2的B组受检标本中有28例检测出沙眼衣原体,阳性率为10.9%。两组阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论两组受检标本中有1例阴性结果内参照没有扩增,在反应中加入内参照DNA与标本中是否存在pcr抑制因素密切相关。