摘要：为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光rt-pcr检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

摘要：为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR Green Ⅰ荧光rt-pcr的鉴别检测方法,针对PPRV-H基因的高变区域设计1对特异性引物,确定反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。60℃退火、76℃收集荧光信号获得试验效果最好,熔解曲线为单一峰,Ⅱ系毒株熔解温度78.63℃,Ⅳ系毒株熔解温度80.08℃,易于区分;最低检测限为10拷贝/μL,批内、批间变异系数均小于0.5%,羊口疮病毒(ORFV)等4种病毒无扩增曲线产生;检测140份临床样本,与国家标准检测方法结果符合率100%。本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光rt-pcr检测方法可以快速、灵敏和特异地鉴别检测出PPRVⅡ系与Ⅳ系毒株,满足疫病快速诊断的需求。

摘要：本研究中，采用TaqMan方法，根据新城疫病毒F基因核苷酸序列，设计合成多对引物，在上游引物和下游引物之间设计多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光rt-pcr方法。经对10株倍比稀释的中强毒力新城疫病毒的尿囊液进行检测后，表明所建立的荧光rt-pcr方法的检测极限在10^-5～10^-7”之间，略低于鸡胚病毒分离方法（10^-8～10^-9）；对收集到的所有新城疫病毒株和常见禽类病毒（包括禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒）进行检测，结果表明建立的方法不能检出其他的常见禽类病毒，特异性良好。进一步用建立的荧光rt-pcr检测人工感染SPF肉鸡的组织脏器、咽喉及泄殖腔拭子及临床样品中的中强毒力的新城疫病毒，并同鸡胚分离结果比较，结果表明荧光rt-pcr的敏感性同鸡胚分离试验基本一致。由于荧光rt-pcr方法快速，从处理样品开始到出结果只需不到4小时，而且检测样品量大，这就充分显示了其快速、敏感、特异的优势。在强调口岸快速通关的今天，该方法的建立无疑为活禽或禽产品的快速检验检疫提供了有效的手段。

摘要：为了建立猪瘟病毒野生株和疫苗株荧光rt-pcr鉴别方法,设计了1对通用引物和2条特异性MGB探针。此外,为防止假阴性结果出现,制备了假病毒用于全程检测监控。测试了本方法的特异性,灵敏度,重复性等技术指标。结果显示,在选定的猪病相关病毒组内特异性符合率达100%;对野毒株和疫苗株的检测灵敏度分别达到1TCID50/mL和0.1 TCID50/mL;重复性实验表明组内和组间变异系数均在0.7-2.2%之间。临床比对试验结果显示,荧光rt-pcr对猪肉、脾脏和血液病料进行猪瘟野毒检测的阳性率分别为66.7%、60.0%、77.8%,而传统方法的阳性率分别为52.4%、40.0%、50.0%;检出率比传统方法要高。此外,临床试验样本中,pcr抑制物在猪肉、脾脏和血液病料中存在的比例分别为9.5%、10.0%和5.6%,显示了假病毒作为内标对pcr检测监控的重要作用。

摘要：目的　建立一种快速、特异、灵敏的SARS冠状病毒(SARS CoV)核酸检测方法。方法　根据GenBank中SARS CoV基因序列,自行设计引物、荧光探针,在PE 770 0扩增仪上探讨工作参数,形成试剂盒,并用研制的试剂检测76份临床SARS样本。结果　简套式荧光rt pcr方法对血清样本、漱口液样本、正常人样本检出率分别为33.3% (12 36 )、6 7.5 % (2 7 4 0 )、0 (0 / 16 0 ) ,与经典套式检测结果一致。而传统一步法荧光rt pcr对样本的检出率分别为13 9% (5 36 )、5 2 5 % (2 1 4 0 )、0 (0 / 80 )。结论　简套式荧光rt pcr核酸检测法是SARS临床早期诊断快速、特异、灵敏的方法。

摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株的基因序列,设计U1和U6两套pcr引物和荧光探针,建立了扩增U1和U6基因的荧光rt-pcr用于检测美洲型PRRSV。用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(HCV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示建立的扩增U1和U6基因的荧光rt-pcr可用于检测PRRSV,其灵敏度为10个拷贝的质粒DNA,而与HCV等非PRRSV无交叉反应。本研究所建立的荧光rt-pcr具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于PRRSV样品的检测。

摘要：本研究根据禽流感病毒H5亚型的RNA4节段,设计、合成多对引物、探针,并通过筛选获得灵敏度、特异性好的组合,在此基础上对荧光rt-RCR反应体系中的各组分进行优化,并建立对各种禽类样品中病毒核酸的提取方法。通过对阳性鸡胚尿囊液及人工攻毒的SPF鸡、肉鸡、肉鸭的各脏器进行检测,并与传统鸡胚病毒分离进行对比,显示该方法与传统鸡胚病毒分离灵敏度接近,但检测时间由原来的21天缩短为4小时。

摘要：经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对，在其F基因上找到1段相对保守序列，根据保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针，以新城疫I系疫苗株（Mukteswar株）作为标准品，通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验，建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光rt-pcr检测新城疫病毒的方法。该方法能检测最低初始病毒浓度为10^2.2ELD50／mL，且在10^8.2～10^2.2ELD50／mL内Ct值与病毒浓度的对数值（1gELD50／mL）呈很好的线性关系，R^2达到0．9975；该方法对禽流感、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应；批间和批内重复性良好；临床样品检测中荧光rt—pcr与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98．5％，50．0％和98．4％。因此，荧光rt—pcr检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法，为新城疫病毒的研究奠定了一定的基础。

摘要：为了建立检测(番鸭)呼肠孤病毒(DRV)感染的方法,本研究根据DRV的σNS基因核苷酸序列设计引物及TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan探针实时荧光rt-pcr检测方法。用已知浓度的重组质粒为标准品,构建的标准曲线的相关系数达到99%。试验表明,该方法的重复性、稳定性、特异性良好,且灵敏度高,可以检测到1.0×102拷贝/μL的标准品,比普通pcr至少高100倍。该检测方法对DRV人工感染番鸭肝脏组织检出率达到100%。本实验所建立的TaqMan探针荧光rt-pcr为的快速检测以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段。

摘要：参照美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列,设计引物和探针,并建立其荧光rt-pcr检测方法,以检测严重危害我国养猪业的此型PRRSV。该法能检测到1 TCID50的PRRSV。用此法检测猪瘟病毒、乙脑病毒、伪狂犬病毒、马动脉炎病毒、圆环病毒Ⅱ型和MARC145细胞的RNA,结果均为阴性。对126份临床样品进行检测应用,检测结果(7份阳性,119份阴性)与病毒分离完全符合。此法中的阳性对照为体外转录的dsRNA,具有高度的稳定性,解决了此类检测方法所用的RNA阳性对照所普遍存在的易于降解的难题。