摘要：目的建立-种可以同时检测EV71、CA16和肠道病毒通用型的三重荧光rt-pcr检测方法,为手足口病监测与应急诊断提供高通量快速检测技术.方法分别在VP1和5’ UTR基因保守区设计EV71、CA16和肠道病毒通用型的特异性检测引物以及Taqman探针,建立并评估三重荧光rt-pcr技术的特异性和敏感性,并对91份疑似手足口病患儿临床标本进行核酸检测与效果验证.结果建立的三重荧光rt-pcr技术可同时对EV71、CA16和肠道病毒通用型进行特异性检测区分,敏感性均可达到0.1TCID50/mL,从核酸提取至完成检测仅需2～3h.91份疑似手足口病患儿临床标本采用三重荧光rt-pcr方法检测,EV71、CA16和其他型别肠道病毒的检出率分别为30.77%、9.89%和5.49%;荧光rt-pcr方法的检出率高于培养分离法.结论建立的三重荧光rt-pcr技术能同时准确分型EV71、CA16和其他型别肠道病毒.

摘要：根据A型猪流感病毒(SIV)的基质蛋白(M)编码基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测A型SIV的荧光rt-pcr方法。结果显示,该方法对H1N1、H3N2和H9N2亚型SIV均呈特异性扩增,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等猪的其他常见病毒无交叉扩增反应;该方法对M基因RNA对照(SIV-M-RNA)的最适线性检测范围为3.8×10~1~3.8×10~8拷贝数/反应,标准曲线方程为Y=-3.4365X+40.091,相关系数(R^2)为0.999 8,最低检出限为38个拷贝数的SIV-M-RNA。对3个不同浓度(3.8×10~3~3.8×10~5 copies/μL)的SIV-M-RNA进行组间和组内重复试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对860份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪场猪鼻拭子样本进行SIV检测,结果进口猪鼻拭子样本的SIV检测均为阴性,17份国内猪场猪鼻拭子样本SIV检测为阳性。本研究提供了一种快速、敏感和特异的A型猪流感病毒检测方法。

摘要：根据GenBank收录的PRRSV基因序列,设计一对引物F、R和一条TaqMan荧光探针P,建立了猪蓝耳病病毒荧光rt-pcr检测方法。该方法敏感性比常规的rt-pcr高100倍,对PRRSV细胞培养物的检测下限可以达到2个TCID50,能特异检测出蓝耳病病毒,并且可以鉴别诊断PRRSV变异株和经典株,同时根据灵敏度试验建立的标准曲线,能够对PRRSV RNA进行相对定量。

摘要：本研究根据GenBank发表的禽副黏病毒4型(APMV-4)基因组序列,在保守区域分别设计了特异性rt-pcr引物和荧光探针,初步建立了可用于检测APMV-4的荧光rt-pcr方法。特异性试验表明本方法特异性强,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征病毒(EDSV)等没有交叉反应。灵敏度试验表明本方法的检测下限为1 EID50,比常规rt-pcr的敏感度高100倍左右。本研究所建立的荧光rt-pcr方法具有快速、准确、灵敏等优点,可用于APMV-4样品的检测。

摘要：根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光rt-pcr方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照（SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA）,最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

摘要：为建立猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）快速检测方法,参照Gen Bank中PEDV的N基因序列,设计引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立了快速检测PEDV的荧光rt-pcr方法,并验证该法的敏感度、特异性和重复性。结果显示：该方法最佳反应体系为上游引物各1.5μL,下游引物各1.8μL,探针0.7μL,酶1μL,缓冲液12.5μL,模板2μL,补足DEPC水至25μL,获得的标准曲线方程为Ct=-3.15×lg拷贝数＋31.72,检测PEDV的敏感度可达0.32 TCID50/100μL,特异性好,对其他猪常见病毒检测结果均为阴性。结果表明：该方法适合猪流行性腹泻快速检测,为该病的诊断和防控奠定了基础。

摘要：为建立猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒一步法荧光rt-pcr鉴别检测方法。本研究参照Gen Bank中猪流行性腹泻病毒以及传染性胃肠炎病毒特异性基因序列,设计特异引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,建立了检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的一步法荧光rt-pcr方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒灵敏度分别可达0.32 TCID_(50)/100μL和1.58 TCID_(50)/100μL,该法对猪轮状病毒(RV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的Taq Man一步法荧光定量rt-pcr检测方法可对猪流行性腹泻和传染性胃肠炎进行快速诊断,适合现场检测,为猪病毒性腹泻的诊断和防控奠定了基础。

摘要：在新冠肺炎疫情防控期间,利用荧光rt-pcr核酸检测以确诊病例并立刻进行进一步治疗至耀要。核酸检测确诊一般需要几个小时,检测方案的效率直接关系到确诊时间,也是疫情发展时收治确诊病人入院的瓶颈环节。因此,寻找高效的检测方案或优化现有方案,急迫且重要。

摘要：新城疫、禽传染性支气管炎与禽流感是可引起禽类呼吸道症状相似的三种急性传染病,且存在混合感染。为建立新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒与禽流感病毒三重rt-qpcr检测方法,该研究对比了GenBank登录的新城疫病毒(NDV)L基因、禽传染性支气管炎病毒(IBV)1a基因和禽流感病毒(AIV)NP基因,经分析选取保守序列设计了三套引物与探针,通过优化检测方法的反应体系,成功建立了可同时检测NDV、IBV和AIV的三重rt-qpcr方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了评估。结果表明,该方法能够特异性检测出NDV、IBV和AIV,有较好的特异性;方法对三种病毒的最低检测限均为3.02×10^(2)copies/μL,有较高的敏感性;重复性实验结果显示批内与批间变异系数均不大于1.28%,有良好的重复性。使用本研究建立的方法对102份临床咽拭子进行检测,并与常规rt-pcr进行比较,总符合率为96.6%。本研究建立的三重rt-qpcr检测方法,特异性强,灵敏度高,可用于NDV、IBV、AIV三种病毒的检测。