摘要：随着抗生素大量而广泛的使用,细菌的耐药性已成为世界范围内关注的问题,对细菌携带耐药基因的检测已成为生物安全调查评估的新途径。本实验应用PCR方法扩增新霉素耐药基因aph,将其克隆于p EASY-T1载体并测序。通过Genbank同源性比较,在aph基因保守区设计了一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,建立了耐新霉素aph基因的LAMP检测方法,其最佳工作条件为:甜菜碱浓度为0.8 mol/L,Mg2+浓度为20 mmol/L,反应温度63℃,时间50 min。此方法可在60 min左右完成对aph基因的检测,特异性好。应用系列稀释的aph基因质粒进行敏感性检测比较,结果表明aph基因的LAMP检测灵敏度与PCR相当,检测限约20个拷贝。对38株葡萄球菌分离株的aph基因的LAMP检测表明,aph基因阳性携带率为84.2%。

摘要：目的克隆葡萄球菌肠毒素O（seo）基因，构建其两种原核表达载体，表达、纯化重组蛋白SEO，并对其生物活性进行初步研究。方法设计引物PCR获得seo成熟肽基因，将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1、pET28a，转化*** BL21、*** BL21（DE3），重组蛋白分别经GST亲和层析、镍螯合层析纯化，利用Westernblot验证重组SEO的免疫原性，MTT法测定重组SEO对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，Caspase3酶活及DNA电泳分析重组SEO诱导细胞凋亡的能力。结果克隆的seo基因序列与报道的序列完全相同。纯化获得重组蛋白GST—SEO和P28-SEO的表达量分别占菌体蛋白的25％和22％。免疫印迹表明两种蛋白均具有良好的免疫原性。生物活性检测表明，低剂量的肠毒素对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作用，较高剂量则会导致细胞凋亡。结论两种重组的SEO仍具有超抗原的活性，对小鼠脾淋巴细胞具有诱导凋亡的能力。

摘要：目的分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)主动外排基因(qacB、qacJ、smr),探讨其在 MRSA 多重耐药中的作用。方法采用计算机引物设计软件(Primer Premier 5.0)设计外排泵基因(qacB、qacJ、smr)引物,用 PCR 和电泳分析方法检测124株 MRSA 主动外排基因;用利血平进行MRSA 协同抑制试验,观察其对利福平和左旋氧氟沙星药敏性的变化。结果 124株 MRSA 中检出外排泵 qacB 基因86株,检出率为69.4%;qacJ 基因45株,检出率为36.3%;smr 基因32株,检出率为25.8%。利血平抑制实验结果显示 MRSA 对左旋氧氟沙星和利福平的最低抑菌浓度值下降2～32倍,表明其耐药性降低。结论 MRSA 存在 qacB、qacJ、smr 等多种主动外排系统,在其多重耐药中起重要作用。

摘要：采用单因素试验和正交试验设计对人工发酵生产传统捆蹄的加工工艺进行研究。通过测定产品的pH、亚硝酸盐含量、氨基态氮含量,优化其生产工艺参数。结果表明:最佳发酵条件为乳酸菌与葡萄球菌比例7∶3,接种量30mL/kg,发酵温度35℃,发酵时间32h。在此条件下制作出的发酵捆蹄酸度适宜,营养丰富。

摘要：肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(***)、腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、马胃葡萄球菌(S. equorum)和松鼠葡萄球菌(S. sciuri)是发酵肉制品中常见的葡萄球菌,为准确、快速地检测和鉴定这些菌种,建立6种葡萄球菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法并进行验证。以上述菌种的gap、rpoB、SodA和SNc为靶基因,设计和筛选菌种特异性引物6对,优化PCR体系,建立6种葡萄球菌的多重PCR鉴定方法。实验结果显示多重PCR的基因组DNA检测灵敏度可达到4 pg,活菌检测灵敏度可达到2×10~2 CFU;采用建立的多重PCR方法对传统肉制品中分离的8株葡萄球菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、生理生化鉴定结果一致。建立的多重PCR方法具有较高的种间特异性,可快速、准确地用于发酵肉制品中肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和腐生葡萄球菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。

摘要：目的明确甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和溶血性葡萄球菌(MRSH)所包含的葡萄球菌染色体mec盒(staphylococcal cassette chromosome meg,SCCmec)类型,并比较两者的差异。方法分别收集本院住院患者临床标本中分离的60株MRSA和88株MRSH。共设计10对引物,采用PCR法分别扩增mec复合体和ccr复合体的各个特征序列,分析其SCCmec类型。结果60株MR- SA均为Ⅲ型SCCmec;88株MRSH中7株为V型SCCmec,1株为Ⅲ型SCCmec,其余均为新的组合或是无法分型。结论SCCmec在MRSA和MRSH中分布特点差别较大,MRSH中可能存在较多新的型别。

摘要：背景:葡萄球菌感染和生物被膜形成受群体感应机制调控。葡萄球菌RNAⅢ抑制肽可以干预葡萄球菌群体感应系统,阻断葡萄球菌细胞间的信号传导通路,进而抑制葡萄球菌的毒素分泌和生物被膜形成,防治葡萄球菌感染。目的:探讨葡萄球菌RNAⅢ抑制肽(RIP)的人工合成方法。设计、时间及地点:单一样本观察。于2006-08/11在北京宣武医院中心实验室完成。材料:Fmoc-AA、Pipredine、TFA、HMP购自美国MERCK公司;DCC、HOBT、DMAP购自美国ABI公司。方法:采用固相合成法合成RNAⅢ抑制肽,HPLC法纯化,进行质谱分析法、酸水解法、红外光谱分析法和内酰胺酶活性测定法检测。主要观察指标:①合成和纯化结果。②分子量测定结果。③组成成分分析结果。④氨基酸序列分析结果。⑤结构分析结果。⑥生物活性鉴定结果。结果:合成的RNAⅢ抑制肽纯度为97.42%,相对分子质量为914.37,与理论相对分子质量基本一致;与天然RNAⅢ抑制肽具有相同的氨基酸组分、氨基酸序列以及空间结构;生物活性检测证明合成RNAⅢ抑制肽具有和天然RNAⅢ抑制肽相同的功效,可以有效抑制细菌产生RNAⅢ。结论:采用固相合成法成功合成RNAⅢ抑制肽,鉴定分析证实合成的多肽和天然RNAⅢ抑制肽蛋白具有相同的结构和功能。

摘要：目的建立一种快速检测葡萄球菌和甲氧西林耐药葡萄球菌的斑点杂交技术。方法设计金黄色葡萄球菌nuc基因、甲氧西林耐药mecA基因、葡萄球菌tuf基因的特异引物,用聚合酶链反应合成其特异DNA探针,并用生物素标记,分别与固定在硝酸纤维素膜上的标准菌株和临床分离株模板DNA杂交,观察其敏感性和特异性。结果3对引物分别扩增出270bp、310bp、370bp3种DNA探针,均具有高度特异性。50株金黄色葡萄球菌tuf、nuc基因均为阳性,mecA基因阳性者22株。30株表皮葡萄球菌tuf基因均为阳性,nuc基因均为阴性,mecA基因阳性者9株。而其他非葡萄球菌与3种DNA探针杂交结果均为阴性。该方法可检测出1ng细菌DNA。结论斑点杂交技术检测耐甲氧西林葡萄球菌快速、有效,具有较高的应用价值。

摘要：硝酸盐还原酶可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐,对肉制品色泽和风味形成尤为重要。分析从如皋火腿中分离得到的4株葡萄球菌的产硝酸盐还原酶特性,研究菌株产硝酸盐还原酶的影响因素。以高产硝酸盐还原酶肉糖葡萄球菌RG-10为研究对象,通过正交试验对其产硝酸盐还原酶条件进行优化,并对优化条件进行验证,各因素对肉糖葡萄球菌RG-10产硝酸盐还原酶的影响程度顺序为Na Cl浓度>温度>时间>KNO3浓度。确定肉糖葡萄球菌发酵产硝酸盐还原酶的最佳发酵条件为时间18 h、Na Cl浓度2.5%、KNO3浓度0.2%、温度42℃,此条件下的硝酸盐还原酶酶活为482 U/mg蛋白。

摘要：mecA是耐甲氧西林葡萄球菌携带的耐药基因。本实验根据克隆的mecA基因序列,在保守区设计了一套环介导等温扩增(LAMP)引物,通过条件优化,建立了耐甲氧青霉素mecA基因LAMP检测方法,其最佳工作条件为:甜菜碱浓度为0.8 mol/L,Mg2+浓度为20 mmol/L,反应温度63℃,时间50 min。此方法可在60 min左右完成对mecA基因的检测,特异性好,mecA基因的LAMP检测灵敏度比PCR高100倍。对38株葡萄球菌分离株的mecA基因的检测表明,阳性携带率为44.7%。