摘要：目的:构建辅酶NADPH高效再生的基因工程菌,获得辅酶NADPH高效再生的最佳工艺条件。方法:利用基因工程技术将辅酶NADPH再生关键酶的基因glk和zwf导入到大肠杆菌BL21中,实现辅酶NADPH循环高效再生,并优化辅酶NADPH再生的工艺条件。结果:成功构建了含有辅酶NADPH再生关键酶两个基因的重组大肠杆菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf;通过正交设计优化试验,获得重组工程菌株产辅酶NADPH的最佳工艺条件是:诱导温度20℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度0.25 mmol/L、接种量1.5%、装液量100 mL/250 mL。在此条件下进行1 L发酵摇瓶诱导培养48 h,辅酶NADPH产量高达151.79μmol/L。结论:研究结果为辅酶NADPH循环再生提供了良好的理论基础。

摘要：背景由于胰岛细胞分离技术难度较大,目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的构建葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础,可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZ1)经EcoR1/BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建逆转录病毒表达载体PLX-GK,用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317,筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系,PCR鉴定。主要观察指标①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果成功构建GK基因逆转录病毒表达载体,经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;产毒细胞系的平均病毒滴度为6.8×108CFU/L,筛选出一株病毒滴度为1.8×109CFU/L稳定产毒细胞系PA317/GK,PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。

摘要：葡萄糖激酶GK是调节体内葡萄糖代谢和参与血糖动态平衡的主要靶点之一。本文针对46个具有GK激动剂活性的吡啶类衍生化合物进行构效关系研究,研究了其结构与活性的关系。基于分子共同骨架叠合用分子力场分析法(COMFA),比较分子相似指数法(COMSIA)两种经典三维定量构效关系(3D-QSAR)方法,建立相应模型,进行分子结构和抗糖尿病活性分析。COMFA模型的交叉验证系数q^2为0.613,相关系数r^2为0.989;COMSIA模型交叉验证系数q^2为0.621,相关系数r^2为0.982。数据证明两种模型都显示出较好的预测性,为设计新的活性更高的小分子激动剂提供了可靠信息。

摘要：目的:构建噻唑类葡萄糖激酶(GK)激动药的三维定量构效关系(3D-QSAR),并进行理性设计。方法:运用比较分子力场分析(Co MFA)的方法,构建噻唑类GK激动药的3D-QSAR模型,通过晶体复合物结构对模型进行验证。对复合物中配体激动剂进行基于片段生长的理性设计,预测所设计分子的活性、药代动力学性质及毒性。结果:高精度的GK激动剂的3DQSAR模型为Co MFA:q^2=0.673,r^2=0.908;其中q^2为交叉验证系数,r^2为非交叉验证系数,激动药与受体蛋白之间的作用模式结果与构建的模型表现一致,18号化合物为全新化合物。结论:GK激动药的3D-QSAR模型可为GK激动药提供理性设计的理论基础,设计得到的分子口服吸收良好、生物预测活性较高,有望成为新的抗2型糖尿病药物分子。

摘要：葡萄糖激酶(GK)催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖,是糖代谢的第一步;GK的活性改变对葡萄糖的代谢影响很大.通过分子动力学模拟研究了葡萄糖激酶活化剂(GKA)对GK活性的影响,探讨了GKA的活化机理.包结自由能分析表明,范德华作用是GK和GKA体系的主要驱动力;与此同时,葡萄糖使得GK和GKA的结合增强.构象分析结果表明,GKA能够在一段时间内限制GK的构象,但不能长久维持GK的活化构象不变,这和以往的实验结果相一致.相关理论分析结果不仅有利于从原子水平解释GKA的活化机理,也可为设计新的用于糖尿病治疗的GKA提供一定的理论参考.

摘要：葡萄糖激酶(glucokinase,GK)是治疗2型糖尿病(T2DM)的新型靶点。为了发现结构简单、活性更高的小分子葡萄糖激酶活化剂,本文基于筛选发现的活性化合物结构,运用电子等排等方法设计并合成了19个结构新颖的水杨酸衍生物。初步活性评价显示,化合物8h对GK的激活倍数达到1.6,优于阳性化合物RO-28-0450。

摘要：目的分析5例青少年起病的成人型糖尿病（maturity—onset diabetes of the young，MODY）患儿临床表现及基因学改变，以提高对于儿童期MODY的认识。方法回顾性分析首都儿科研究所2015年1月1日至12月31日初次诊断的糖尿病患者78例。其中9例疑诊MODY，基因确诊5例。临床资料收集：性别、年龄、主诉、家族史、体质量指数、空腹血糖、葡萄糖耐量试验2h血糖、空腹血胰岛素、血胰岛素、血糖化血红蛋白。2例患儿进行动态血糖监测。基因检测方法：设计MODY捕获芯片，包含12个明确与MODY1-13型相关的基因及4个人类基因突变数据库有研究报道可能与MODY相关的基因，共16个基因。采用的技术路线为以目标序列捕获联合高通量测序技术的方法，应用Illumina Hiseq2000高通量测序仪进行测序，经过生物信息分析，最后Sanger测序验证及父母传递分析。结果2015年确诊的糖尿病患者78例中5例诊断为MODY，占6．4％。5例患儿男女比例为2：3；诊断年龄为2—11岁，中位诊断年龄3岁。2例患儿于体检时发现，2例因“肺炎”、1例因“腹泻”住院期间发现血糖异常。4例患儿母亲有妊娠糖尿病病史，1例父亲患有糖尿病。患儿体质量指数在15．68—23．40kg／m2。空腹血糖波动在6．3～7．2mmol／L。空腹血胰岛素为0．5～8．0IU／L。葡萄糖耐量试验后2h血糖为8．6～10．8mmol／L。血糖化血红蛋白波动在5．5％～6．7％。动态血糖监测提示患者血糖波动在3．9—13．0mmol／L。基因结果提示5例患者均为GCK突变。分型为MODY2型。基因突变发生在Exon72例，Exon4、Exon5、Exonl0各1例。结论本组确诊MODY患儿均为体检或患感染性疾病时发现血糖异常。均有阳性家族史。体质量指数波动范围大。空腹血糖轻度增高，空腹胰岛素均正常。糖耐量试验均提示糖耐量异常。糖化血红蛋白正常或轻度增高。MODY2型最为常见。儿童常见MODY基因型和成人可能有所不同。

摘要：为从南方鲇(Silurus meridionalis)中扩增葡萄糖激酶(GK)基因,根据已报道的GK基因结构中的氨基酸保守区域,设计简并引物;从南方鲇肝胰脏中迅速抽提RNA,将扩增出的产物克隆到pMD18-T载体上并导入到大肠杆菌DH5α中;阳性克隆鉴定后测序。将测序得到的南方鲇GK基因与已知的GK基因进行核苷酸序列比较,结果表明其与鲤(Cyprinus carpio)的同源性较高,达到83%;将此基因片段与其他已知的GK基因做出进化关系的确定,用Phylip软件NJ bootstrap方法构建GK系统树,它与草鱼(Ctenopahryngodon idellus)、鲤、鲫(Carassius aura-tus)、翘嘴红鲌(Eruthroculter ilishaeformis)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鲑(Salmo salar)、金头鲷(Sparus au-rata)、黄易鲷(Rhabdosargus sarba)等以较高的支持度形成一个分支。本研究成功地从南方鲇肝胰脏中扩增到长度为688 bp的编码蛋白酶的基因片段,为今后克隆南方鲇GK基因全长序列及该基因在不同营养条件下的表达等研究奠定基础。