摘要：目的:探究GRP78对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响以及作用机制。方法:采用RNAi技术沉默SiHa细胞中GRP78基因的表达。将针对不同位点设计的siRNA通过脂质体介导分别转染入SiHa细胞,通过免疫印迹法和qRT-PCR分别检测转染前后SiHa细胞GRP78蛋白和GRP78 mRNA的表达。划痕实验检测SiHa细胞的迁移能力;Transwell实验检测SiHa细胞的侵袭能力;免疫印迹法检测上皮间质转化相关蛋白及增殖相关蛋白的表达;流式细胞术检测SiHa细胞的凋亡率。结果:转染后,GRP78 mRNA和GRP78蛋白表达水平均明显降低且GRP78-siRNA1501的沉默效果最显著,基因水平和蛋白水平的检测总体趋势相符合;此外,与空白组和NC-siRNA组相比,GRP78-siRNA1501组SiHa细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显增高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平明显降低,且增殖相关蛋白P-AKT^(ser473)、P-GSK3β^(ser9)、Cyclin D1、CDK4表达水平也明显降低;Annexin V-FITC/PI双染结果显示,GRP78-siRNA1501组SiHa细胞的凋亡率明显高于NC-siRNA组。结论:沉默SiHa细胞中GRP78基因,会导致SiHa细胞增殖、侵袭和迁移能力减弱,并促进其凋亡。增殖能力减弱可能与抑制AKT/GSK3β/Cy-clin D1信号通路有关,侵袭和迁移能力减弱可能与抑制上皮间质转化的进程有关。

摘要：目的探索流体剪应力对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达的影响。方法以HUVECs作为实验细胞,设计并构建流体动力学模拟实验系统,控制流体动力学模拟实验系统中灌流液的流速,以实现对实验细胞施加不同的流体剪应力。按实验细胞在实验系统中所承受的不同流体剪应力,将实验细胞分为低剪应力组(A组;0.4 Pa)、中剪应力组(B组;0.8 Pa)和高剪应力组(C组;1.2 Pa)。每组HUVECs包含3个细胞玻片,每个玻片经实验系统灌流液反复循环流经12 h。采用蛋白质印迹法对各组细胞中GRP78和CHOP蛋白水平进行检测,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术测定各组细胞GRP78和CHOP蛋白及其信使RNA(mRNA)相对水平。应用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析。结果(1)A、B、C组HUVECs中GRP78蛋白相对表达水平分别为1.33±0.46、0.93±0.34、0.64±0.30;多组间比较差异有统计学意义(F=36.17,P<0.05)。A组GRP78蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组GRP78蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0013)。3组HUVECs中CHOP蛋白相对表达水平分别为:A组1.29±0.38,B组0.90±0.34,C组0.59±0.29;多组间比较差异有统计学意义(F=41.27,P<0.05)。A组CHOP蛋白相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组CHOP蛋白相对表达水平高于C组(P=0.0004)。(2)A、B、C组HUVECs中GRP78 mRNA相对表达水平分别为18.3±3.4、11.3±1.8、5.4±2.2;多组间比较差异有统计学意义(F=189.20,P<0.05)。A组GRP78 mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组GRP78 mRNA相对表达水平高于C组(P<0.01)。3组HUVECs中CHOP mRNA相对表达水平分别为:A组20.4±3.8,B组14.2±2.1,C组7.8±1.3;多组间比较差异有统计学意义(F=171.80,P<0.05)。A组CHOP mRNA相对表达水平高于B组、C组(均P<0.01),B组CHOP mRNA相对表达水平高于C组(P<0.01)。结论低流体剪应力可能增加HUVECs中GRP78、CHOP的蛋白及其mRNA表达水平。

摘要：目的设计并构建编码大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的短发夹样RNA(shRNA)慢病毒载体,用以建立稳定沉默GRP78基因的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。方法设计并合成3条编码大鼠GRP78mRNA的shRNA质粒表达载体,用三质粒包装系统包装成慢病毒,并以相应慢病毒转导大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。经流式细胞分选术(FCAS)筛选出绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,采用real-time PCR及Western blot方法检测GRP78基因的mRNA和蛋白表达。结果测序证实,成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3。慢病毒转导AR42J细胞后,经荧光显微镜和FCAS证实转导效率>85%。经real-time PCR验证,与未处理组相比,LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3处理组对GRP78mRNA表达的沉默效率分别为69.4%±1.42%、74.7%±1.69%和86.6%±1.73%(P0.05)。Western blot结果显示各组GRP78蛋白表达与mRNA表达趋势一致。结论成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体,建立了稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J,为探讨GRP78基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供了新的细胞模型。

摘要：目的构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因过表达质粒,体外转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并观察其表达和定位。方法根据Pub Med数据库中GRP78基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并分别将其克隆至含有绿色荧光蛋白(GFP)的p LVX-IRES-Zs Green1载体以及含有Flag标签的CMV-10载体,经酶切、测序对重组质粒进行鉴定。转染成功构建的质粒至HUVECs,免疫荧光染色法观察蛋白表达和定位,Western blotting验证蛋白过表达情况。结果酶切和测序鉴定表明成功构建p LVX-GRP78-IRES-Zs Green1以及CMV-Flag-GRP78的基因重组质粒;将成功构建的p LVX-GRP78质粒转染至HUVECs,可观察到大量绿色荧光表达;将成功构建的Flag-GRP78质粒转染至HUVECs,免疫荧光检测表明Flag-GRP78蛋白表达定位于内质网;Western blotting证实p LVX-GRP78和Flag-GRP78成功过表达。结论成功构建p LVX-GRP78、Flag-GRP78重组质粒,转染HUVECs并观察到其内质网定位。

摘要：目的探讨内质网应激在大鼠酒精陡肝病肝细胞凋亡中的作用。方法采用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型，分别于4、8、12、16周随机处死动物，留取血清和肝组织，同时设置正常对照组。检测大鼠血清总同型半胱氨酸（tHcy）浓度，比色法测定大鼠肝组织胱硫醚β合成酶（CBS）活性，逆转录-聚合酶联反应和免疫组织化学法分别检测肝组织葡萄糖调节蛋白78（GRP-78）、需钙蛋白酶2（calpain-2）和caspase-12前体蛋白（procaspase-12）的mRNA和蛋白质表达情况；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肝细胞凋亡情况。组间数据比较用完全随机设计的方差分析（SNK法或Tamhane’s法），相关陛分析用Pearson直线相关分析法。结果模型组大鼠16周末出现肝细胞弥漫小泡性脂肪变性、窦周纤维化，汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成。正常对照组及造模4、8、12、16周时，大鼠血清tHcy浓度分别为（5．10±0．56）μmol／L、（6．95±0．17）μmol／L、（8．36±0．17）μmol/L、（9．45±0．28）μmol／L和（9．85±0．12）μmol／L，肝组织匀浆CBS浓度分别为（613．92±17．09）U／g、（573．53±24．96）U／g、（503．42±44．67）U／g、（438．02±14．67）U／g和（390．45±31．17）U／g，随着造模时间的延长，tHcy浓度逐渐升高（F=338．60，P〈0．01），CBS活性逐渐降低（F=91．90，P〈0．01），且二者呈负相关关系（r=-0．632，P〈0．01）。随着造模时间的延长，GRP-78、calpain-2和caspase-12的mRNA相对表达量逐渐升高（F值分别为216．19、128．91和95．80，P值均〈0．01），且GRP-78mRNA的表达与tHcy浓度呈正相关（r=0．617，P〈0．01）GRP-78和calpain-2的蛋白质表达量逐渐增多，procaspase-12的蛋白质表达量逐渐减少。正常对照组及造模4、8、12、16周的大鼠肝细胞凋亡指数分别为2．17％±1．06％、29．59％±2．62％、40．91％±4．70％、57．39％±6．13％和65．71％±9．78％，呈上升趋势（F=188．30，P〈0．01）。结论肝细胞凋亡可能与CBS涪陛降低导致高同型半胱氨酸血症，从而诱发内质网应激，进而激活calpain-2和caspase-12的信号转导通路有关，这可能为酒精l生肝病发病的重要机制之一。

摘要：目的探讨RNA干涉技术(RNAi)沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的影响,阐明GRP78基因沉默对SKOV3细胞侵袭力抑制作用的生物学机制。方法设计并构建pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒,脂质体介导转染至SKOV3细胞。RT-PCR和Western印迹法检测GRP78基因表达;RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测细胞迁移率。结果 RT-PCR及W estern印迹检测转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞GRP78基因表达抑制;RT-PCR结果显示与对照组相比转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞穿透细胞数(P<0.05)和迁移率均明显降低(P<0.05)。结论①转染GRP78 siRNA重组质粒有效抑制SKOV3细胞GRP78基因表达;②抑制GRP78基因表达能降低SKOV3细胞的侵袭力和迁移力,有望为抑制卵巢癌转移基因治疗提供新的靶点。

摘要：目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡的影响及机制。方法设计、合成针对GRP78基因的短发夹RNA干扰序列,构建GRP78载体质粒,将其转染入293T细胞,包装产生慢病毒(GRP78 shRNA)。将培养好的SKOV3细胞随机分为对照组、空白载体组、实验组,将空白质粒、GRP78shRNA分别转染至空白载体组、实验组。用MTT法检测各组细胞生长抑制率,用流式细胞术检测细胞凋亡率,用Western blotting法检测细胞内GRP78、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)及增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)蛋白表达。结果转染24、48、72 h,与对照组、空白载体组比较,实验组细胞生长抑制率升高(P均<0.05);且实验组各时间点细胞生长抑制率比较差异有统计学意义(P均<0.05)。转染72 h,与对照组、空白载体组比较,实验组细胞凋亡率升高(P均<0.05)。转染72 h,与对照组、空白载体组比较,实验组GRP78蛋白相对表达量降低,CHOP、Caspase-3蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。结论沉默SKOV3细胞内GRP78基因后,激活内质网应激凋亡信号通路,从而抑制细胞增殖、促进其凋亡。

摘要：目的:探究在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中内质网应激(ERS)与巨噬细胞极化的相关性。方法:广西医科大学实验动物中心提供的C57BL/6小鼠,20~40 g,20只(雌雄各半),使用随机数表法分为4组,每组5只,假手术组(Sham组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、衣霉素+I/R组(TM+I/R组)、4-苯基丁酸+I/R组(4-PBA+I/R组)。Sham组单纯开胸后垫高冠状动脉;I/R组结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注2.5 h;TM+I/R组及4-PBA+I/R组,分别腹腔注射TM及4-PBA,结扎左前降支30 min,再灌注2.5 h。流式细胞术检测巨噬细胞募集数量;苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织、免疫组织化学法观察心肌细胞形态;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测心肌ERS标记蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、巨噬细胞极化标记蛋白诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及核因子-κB(NF-κB)通路标记蛋白p65的蛋白表达量。组间比较采用完全随机设计双样本t检验。结果:流式细胞术结果,4-PBA+I/R组(0.192±0.019)、I/R组(0.308±0.043)和TM+I/R组(13.112±0.462)巨噬细胞募集数目均高于Sham组(0.116±0.03,t=8.835、9.928、62.941,P均<0.05),4-PBA+I/R组低于I/R组(t=-13.485,P<0.05),而TM+I/R组则高于I/R组(t=62.011,P<0.05)。心肌ERS标记蛋白GRP78、巨噬细胞极化标记蛋白iNOS免疫组织化学,Sham组为[(9.3±3.2)%、(7.6±3.9)%,P<0.05]心肌组织染色出现弱阳性细胞质染色;4-PBA+I/R组为[(18.4±2.4)%、(22.3±2.1)%,P<0.05]出现弱阳性细胞质染色;I/R组为[(46.0±1.3)%、(33.6±4.9)%,P<0.05]出现阳性的细胞质染色,TM+I/R组为[(76.2±9.3)%、(79.3±5.2)%,P<0.05]出现强阳性细胞质染色。Western blot结果显示4-PBA+I/R组、I/R组和TM+I/R组GRP78、iNOS、p65蛋白表达量高于Sham组(t=1.298、3.934、6.128,P<0.01),4组GRP78蛋白表达量分别为0.716±0.305、0.308±0.043、1.589±0.349、0.518±0.141、4组iNOS蛋白表达量分别为0.416±0.207、0.748±0.274、1.323±0.298、0.223±0.132、4组p65蛋白表达量分别为0.687±0.214、1.101±0.496、1.697±0.959、1.697±0.959,4-PBA+I/R组蛋白表达(0.716±0.305、0.416±0.207、0.687±0.214)均低于I/R组分别为:(0.308±0.043、0.748±0.274、1.101±0.496,t=-13.485,P<0.01),TM+I/R组蛋白表达(1.589±0.349、1.323±0.298、1.697±0.959)均高于I/R组(0.308±0.043、0.748±0.274、1.101±0.496,t=62.011,P<0.01);GRP78与iNOS蛋白表达具有正相关性[相关系数(r^(1))=0.998,P<0.01];p65、GRP78与iNOS蛋白表达具有正相关性[相关系数(r^(2))=0.989,(r^(3))=0.978,P<0.01]。结论:在MIRI中,ERS和M1型巨噬细胞,两者具有正相关性,ERS是巨噬细胞极化重要调节因子;心肌ERS可能是通过NF-κB p65来调节巨噬细胞极化。