摘要：目的:构建辅酶NADPH高效再生的基因工程菌,获得辅酶NADPH高效再生的最佳工艺条件。方法:利用基因工程技术将辅酶NADPH再生关键酶的基因glk和zwf导入到大肠杆菌BL21中,实现辅酶NADPH循环高效再生,并优化辅酶NADPH再生的工艺条件。结果:成功构建了含有辅酶NADPH再生关键酶两个基因的重组大肠杆菌BL21/pETDuet-1-glk-zwf;通过正交设计优化试验,获得重组工程菌株产辅酶NADPH的最佳工艺条件是:诱导温度20℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度0.25 mmol/L、接种量1.5%、装液量100 mL/250 mL。在此条件下进行1 L发酵摇瓶诱导培养48 h,辅酶NADPH产量高达151.79μmol/L。结论:研究结果为辅酶NADPH循环再生提供了良好的理论基础。

摘要：目的探讨应用逆转录-PCR-变性梯度凝胶电泳法(RT-PCR-DGGE)对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因缺陷女性携带者人群进行分子诊断的可行性。方法对54例G6PD基因缺陷可疑携带女性的血液标本,应用外周血提取总RNA并逆转录成cDNA;针对已报道的中国人群17种突变位点,以cDNA为模版,分段设计6对DGGE引物,PCR扩增、DGGE筛查分型,必要时进行测序验证。结果54例可疑标本共检出1例1024C/T、20例1376G/T、12例1388G/A,共检出杂合突变标本33例,总检出率为61.1%。结论RT-PCR-DGGE对G6PD基因缺陷女性携带者人群具有较高的检出率,具有临床诊断意义。

摘要：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PDH)是戊糖磷酸途径的第一个关键酶,催化葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖酸-δ-内酯。家蚕微孢子虫有较为完整的戊糖磷酸途径,该途径除提供糖酵解的中间代谢物外还可形成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)从而抵抗生物体内的氧化刺激。为了解G6PDH基因在微孢子虫生长发育过程中的作用,根据家蚕微孢子虫G6PDH基因序列设计特异引物克隆了该基因,并对其序列特征进行生物信息学分析,进一步采用荧光定量PCR分析G6PDH基因在家蚕感染不同时间点的中肠组织中的转录水平。结果表明,克隆的家蚕微孢子虫G6PDH基因编码区全长1 305 bp,编码434个氨基酸,预测的G6PDH蛋白无信号肽,分子质量为50.8 kD,等电点为5.22,没有跨膜结构域,存在磷酸化位点,不存在N-糖基化位点及O-糖基化位点;家蚕微孢子虫感染家蚕后,从2 h起G6PDH基因表达量开始升高,至12 h时达到最大值,在24~72 h虽然有逐渐降低的趋势,但趋势并不明显,96 h后开始显著降低,至144 h表达量达到最低,而后在168 h时表达量又有所回升。推测G6PDH基因参与家蚕微孢子虫发芽、增殖以及成熟等整个生命周期。

摘要：目的:研究两种改良方法与现有的WHO公认的红细胞G6PD/6PGD酶紫外比值法(UVST法)对女性杂合子的检出率。方法:抽取经变性高效液相色谱法(PE/DHPLC)确诊的女性杂合子全血标本200份分别用WHO公认的UVST法(常规方法 A)及两种改良法(改良方法 B和C)检测,分析两种改良方法与常规方法对G6PD缺乏症检测结果的差异性和对G6PD缺乏症杂合子的检出率。结果:改良方法 B、C的G6PD/6PGD比值与常规方法 A比较差异有统计学意义(P<0.05)。PE/DHPLC检测(尤其是家系调查)结果表明对女性杂合子的检出率:改良方法 C为98%,优于改良方法 B的检出率(92%),明显高于常规方法 A的检出率(79.5%)。结论:在WHO的UVST法的基础上进行改良的方法 C可提高G6PD缺乏症女性杂合子的检出率。

摘要：研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-U6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-timePCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PD!).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD!的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase-3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.

摘要：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)是戊糖磷酸途径的关键酶,在植物响应胁迫方面发挥重要作用。本研究对白木香转录组数据进行分析,设计特异性引物,首次从白木香中克隆得到3条AsG6PDHs基因的cDNA序列,分别命名为AsG6PDH1、AsG6PDH2和AsG6PDH3,其开放阅读框(ORF)分别为1809、1767、1548 bp,编码蛋白分别含有602、588、516个氨基酸,蛋白分子质量分别为68.02、67.02、59.35 kDa。3个G6PDH蛋白的氨基酸序列与其他植物G6PDH的氨基酸序列相似性比较高,都含有G6PDH蛋白的3个特征性序列。系统进化树显示AsG6PDH1和AsG6PDH2属于质体G6PDH,AsG6PDH3属于胞质G6PDH。组织特异性分析结果表明,AsG6PDH1和AsG6PDH2主要在根中表达,AsG6PDH3在各组织中表达量都比较高,茎中表达量最高。实时荧光定量PCR结果显示盐、干旱、低温和重金属胁迫都能够诱导白木香中3个AsG6PDHs基因表达,其中干旱胁迫对AsG6PDH1和AsG6PDH2的转录水平影响最显著,重金属胁迫对AsG6PDH3的表达水平影响最显著。同时,盐、干旱、低温和重金属胁迫都能够提高愈伤组织中G6PDH酶活性,其中干旱胁迫对白木香愈伤组织中G6PDH酶活性影响最显著。本研究为进一步阐明G6PDH基因在白木香防御反应中的作用和沉香结香机制奠定基础。

摘要：【目的】探讨膜反向斑点杂交法在广东人G6PD基因6种常见突变同步检测中的应用。【方法】用高铁血红蛋白还原试验和G6PD/6-PGD酶活性比值法进行G6PD缺乏症筛查。应用多重PCR方法扩增G6PD基因目的片段。用Premier Primer6.0软件设计和优化针对广东人常见6种G6PD基因突变型的特异性寡核甘酸探针,用乙基-3-二甲氨基丙碳二亚胺(EDC)法处理尼龙膜并固定探针,制成G6PD基因突变检测用膜条。多重PCR扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行杂交,通过显色反应判读结果。以G6PD基因测序为金标准,对膜反向斑点杂交法进行评价。【结果】26例标本中膜反向斑点杂交法检测结果:95A→G突变型5例,1024C→T突变型3例,1376G→T突变型8例,1388G→A突变型7例,392G→T突变型1例,未发现1311C→T突变型,有两例检测为阴性。膜反向斑点杂交法未能测出的2例标本经基因测序证实存在392G→T突变,其余24例膜反向斑点法与基因测序法的结果完全一致,符合率为92.3%(24/26)。【结论】在优化探针设计和杂交条件前提下,膜反向斑点杂交法可用于广东人G6PD基因6种常见突变型的同步检测。

摘要：由GND编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是戊糖磷酸途径的关键酶。为了解发菜GND分子信息以及对干旱胁迫的响应机制,该研究设计了特异性引物克隆发菜GND全长,进行序列分析、原核表达和MALDITOF-TOF/MS鉴定,并对干旱胁迫下发菜GND的差异表达水平和G6PDH活性进行分析。结果表明:(1)发菜GND全长1 431bp(GenBank登录号为KX553955),与点形念珠藻(73102)的GND核苷酸序列相似性为96%,G6PDH氨基酸相似性为98%;氨基酸序列中第26和27位的Ile疏水性最强,在第302位的Arg亲水性最强,Thr有19个磷酸化位点,Ser有18个磷酸化位点,Tys有5个磷酸化位点,二级结构和三级结构主要由α螺旋、β折叠、β转角和随机卷曲构成。(2)将GND基因进行原核表达,获得47.23kD的外源表达蛋白G6PDH。(3)随干旱胁迫程度加剧,GND在转录水平的表达量和G6PDH活性均逐渐增加。研究结果为进一步探讨干旱胁迫条件下发菜GND表达调控奠定了基础。