摘要：为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准品。通过优化反应体系建立多重荧光定量PCR检测方法,并用此方法检测临床样品。结果显示,该多重荧光定量PCR标准曲线呈线性关系,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV的扩增效率分别为100%、91%、91%、95%;该方法具有较高的灵敏性和特异性,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV阳性质粒的最低检出量分别为17、12、8和9 copies/μL,与口蹄疫病毒、腐败梭菌、布鲁菌及弓形虫无交叉反应;其重复性较好,组间变异系数和组内变异系数均小于5%。对232份样品进行检测,用该多重荧光定量PCR分别检出9份BTV、3份PPRV、3份CaPV和24份ORFV阳性样品,而用常规PCR分别检出7份BTV、3份PPRV、0份CaPV、12份ORFV阳性样品。综上,该方法能够同时检测BTV、PPRV、ORFV和CaPV,可用于羊病的鉴别诊断、流行病学调查和疫病防控。

摘要：为建立快速鉴别蓝舌病病毒血清29型(BTV-29)的方法,根据BTV-29型毒株基因节段2(Seg-2)的序列特征,分别设计用于RT-PCR与q RT-PCR方法的特异性引物与Taq Man探针,通过试验确定其敏感性,用BTV-1~BTV-24等核酸作为对照评价其特异性。对BTV-29感染动物血液样本中的病毒核酸进行监测,并用BTV群特异q RT-PCR方法验证其可靠性。结果显示,建立的BTV-29特异RT-PCR的灵敏度是1.12×10^(1)copies/μL,而BTV-29特异q RT-PCR的灵敏度是1.12×10^(2)copies/μL,均与BTV-1~BTV-24、流行性出血病病毒、帕利亚姆病毒和阿卡斑病毒之间无交叉反应;用BTV-29特异q RT-PCR检测BTV-29型感染山羊血液中的BTV-29核酸的动态变化,结果与BTV群特异q RT-PCR检测结果基本一致。本研究建立的BTV-29特异RT-PCR和q RT-PCR方法均具有良好的特异性和较高的灵敏度,能快速鉴别BTV-29,为BTV-29的致病性、诊断与流行病学研究提供了技术保障。

摘要：为建立蓝舌病病毒（BTV）群特异性核酸检测方法,本研究针对BTV S10基因保守区域设计并合成1对特异性引物,建立了一步RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性试验、敏感性试验以及临床样品的检测.实验结果表明：该方法对BTV1～24型均有特异性反应,而对茨城病毒（IBAV）、中山病毒（CV）和赤羽病病毒（AKAV）无交叉反应,具有良好的特异性;最低检出量为102 TCID50/mL.此外,该方法能有效的从羊的抗凝血样品中检测出BTV核酸.本研究所建立的一步RT-PCR检测方法可以用于BTV的快速检测及流行病学调查.

摘要：本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV RT-LAMP检测方法;对46株中国分离的12种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)代表毒株进行检测,进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT-LAMP及qRT-PCR检测,验证建立的RT-LAMP检测方法的准确性和可靠性。试验结果表明,本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64℃,扩增45 min;反应体系中外引物∶内引物:环引物的最佳浓度及比例为0.2μmol·L^(-1)∶0.6μmol·L^(-1)∶0.4μmol·L^(-1)。该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸,与动物流行性出血病病毒(EHDV)、中山病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)、口蹄疫病毒(FMDV)及非洲马瘟病毒(AHSV)核酸均无交叉扩增现象;最低可检测4.5拷贝·μL^(-1)的BTV核酸。对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性;120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别(McNemar检验P>0.05),符合率为95.0%;60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致,以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠,对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果。本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点,为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持,具有较好的应用前景。

摘要：为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因原核表达蛋白并检测其生物学活性,根据Genbank登录的BTV VP7基因,设计1对引物,运用RT-PCR扩增技术获得BTV VP7目的片段,然后定向克隆到pPROEXHTb原核表达载体上,再转化重组质粒pPROEXHTb-VP7到BL21感受态细胞,IPTG诱导,表达产物纯化,进行SDS-PAGE鉴定及Western-blot反应原性分析.结果表明:表达的VP7目的蛋白大小为35ku,Western-blot分析表明纯化后的蛋白可以与BTV单克隆抗体发生特异性反应.

摘要：为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒（BTV）10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒（PPRV）、口蹄疫病毒（FMDV）的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。

摘要：为建立检测蓝舌病病毒(BTV)和流行性出血病病毒(EHDV)的快速诊断方法,笔者根据BTV的第10基因节段(Seg-10)和EHDV的第5基因节段(Seg-5)序列,分别设计BTV与EHDV的特异性引物和TaqMan探针,经过反应条件优化,建立了同时检测两种病毒的双重荧光定量RT-PCR方法,并进行了特异性、灵敏度、重复性和临床样品检测验证。用该方法对BTV Seg-10和EHDV Seg-5节段的体外转录ssRNA为模板绘制标准曲线,相关系数(R^2)均大于0.995,线性关系较好;该方法可检测不同血清型的BTV和EHDV,与阿卡斑病病毒(AKAV)、中山病病毒(CHUV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)和牛流行热病毒(BEFV)无交叉反应,表明该方法特异性强;对2种标准品的检出极限均为10 copies/uL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内和组间重复试验的变异系数均小于2%;用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR方法,对100份血液样品和50份病毒液分别进行检测,符合率均大于90%。以上结果表明所建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有快速、准确、敏感和稳定等优点,为BTV和EHDV感染的早期快速诊断、高通量检测及流行病学调查提供了有效的技术方法。

摘要：为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床样品进行检测。结果显示,该方法与口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒等牛、羊常见疾病病原无交叉反应;对两种重组质粒标准品的检出极限均为1×10~2copies/L;批内和批间重复试验的变异系数均小于2.55%。临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样品中BTV和EHDV的核酸。结果表明,本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以为BTV和EHDV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。

摘要：为建立针对我国流行的12种蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)血清型的特异性RT-PCR检测方法,本研究根据我国流行BTV毒株Seg-2的高度保守区域,设计出12对BTV血清型特异性扩增引物,建立了RT-PCR方法,并对该RT-PCR方法的反应条件、引物特异性与灵敏性进行了优化与验证;以我国分离的162株BTV为检测对象,对其血清型进行鉴定并构建系统发生树。结果显示,建立的BTV血清型RT-PCR具有良好的特异性与灵敏度:设计的12对引物仅与对应血清型BTV核酸模板产生特异性PCR扩增,与其余血清型毒株之间无交叉扩增现象;对不同血清型BTV核酸的检测灵敏度在1.28×10^2copies(BTV-2)至9.62×10^2copies(BTV-1)之间。对我国分离的BTV毒株的RT-PCR血清型鉴定与测序结果显示,162株BTV分属12种血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24),根据Seg-2序列构建的系统发生树显示,我国流行BTV血清型毒株的Seg-2序列与对应血清型的BTV标准参考毒聚为一簇,分属9个基因群(A、B、C、E、F、G、H、I和J基因群)。本研究建立的BTV血清型特异性RT-PCR方法为我国流行BTV的检测、诊断与分子流行病学调查提供了可靠的技术手段。

摘要：为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过“鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞”接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。