摘要：目的研究中国仓鼠卵巢上皮(cHO)细胞是否表达蛋白激酶c(PKc)α亚型。方法参照GenBank数据库PKcα亚型的cDNA序列,通过EMBL-EBI数据库的cLUSTALW选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKcα亚型的特异引物,RT-PcR扩增cHO细胞PKcα亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKcα连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Western blotting方法检测cHO细胞中PKcα亚型。结果RT-PcR和Western blotting方法均表明cHO细胞表达PKcα亚型,并经测序证实。结论cHO细胞中发现PKcα亚型的存在,为深入研究PKcα亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。

摘要：目的阐述蛋白激酶c(protein kinase c,PKc)与免疫系统的关系并综述近年来以PKc为靶点按不同结构修饰的免疫抑制剂研究。方法根据已报道的蛋白激酶c参与的免疫系统有关的细胞信号转导通路和PKc免疫抑制剂结构修饰的文献,对PKc与免疫系统的关系进行简单概述,并将具有免疫抑制活性的PKc抑制剂以结构分类综述。结果蛋白激酶c在免疫系统中发挥着重要作用,其与很多免疫疾病的发生密切相关。设计合成小分子化合物来抑制蛋白激酶c活性成为治疗自身免疫疾病及其他免疫性疾病的最佳策略。通过高通量筛选、结构修饰等方法已获得了大量以蛋白激酶c不同亚型尤其是PKcθ为靶点的高效低毒新型免疫抑制剂,如AEB071、PKc412、LY3176正处在临床前和临床研究阶段。结论随着研究的不断深入,会有更多的具有免疫抑制活性的蛋白激酶c抑制剂进入临床研究或上市。

摘要：背景:蛋白激酶c家族有3组,经典型蛋白激酶c及非典型蛋白激酶c和新奇型蛋白激酶c。一些实验证实在低氧环境中,蛋白激酶c家族在脑缺血低氧预刺激中发挥了重要作用。目的:建立细胞缺氧模型,观察在细胞水平上低氧激活经典型蛋白激酶c各亚型(α,βⅠ,βⅡ,γ)膜转位现象的影响。设计:以细胞为对象,随机区组设计。单位:首都医科大学基础医学院神经生物学系。材料:实验于2004-05在首都医科大学神经生物学系细胞培养室完成。由本实验室培养的传代细胞,具有神经元特性的人神经母细胞瘤细胞系。方法:应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和经典型蛋白激酶c蛋白印迹分析和免疫细胞化学等生化技术,观察培养的细胞经过0～24h不同时间段,低氧环境为体积分数0.01的氧气,体积分数0.05的二氧化碳,体积分数0.94的氮气,对人神经母细胞瘤细胞内经典型蛋白激酶c-α及βⅠ和βⅡ细胞膜转位水平的影响。主要观察指标:①观察持续低氧对人神经母细胞瘤细胞内经典型蛋白激酶c膜转位影响采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和经典型蛋白激酶c蛋白印迹分析检测。②观察持续低氧对人神经母细胞瘤细胞内经典型蛋白激酶c膜转位影响采用免疫细胞化学方法检测。结果:①经典型蛋白激酶c-α及βⅠ和βⅡ细胞膜转位水平均随持续性低氧时间的延长而明显增高(P<0.05),尤以经典型蛋白激酶c-βⅠ亚型在持续性低氧4h后的增高最为显著(P<0.001)。②无论在常氧还是在持续性低氧状态下,在人神经母细胞瘤细胞内均未检测到经典型蛋白激酶c-γ亚型的蛋白表达。应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和经典型蛋白激酶c蛋白印迹分析和免疫细胞化学实验检测的结果均一致。结论:①在持续低氧的条件下存在于人神经母细胞瘤细胞内经典型蛋白激酶c-α及βⅠ和βⅡ亚型均被激活,发生膜转位变化。②经典型蛋白激酶c-γ亚型可能不存在于人神经母细胞瘤的细胞系中,或者这种细胞系某种特性已丧失。

摘要：背景:铅暴露引起的动物学习记忆障碍与脑细胞中蛋白激酶c(proteinkinasec,PKc)活性改变是否有关系呢?目的:研究慢性铅暴露下发育期小鼠大脑组织PKc活性变化规律及其对小鼠记忆发育的影响。设计:以实验动物为研究对象,随机对照的验证性实验研究。单位:卫生部细胞生物学重点实验室。材料:实验在中国医科大学生物化学与分子生物学实验室完成。选择五六周龄昆明种小白鼠72只。方法:以不同浓度的醋酸铅饲喂交配后的雌鼠,其幼崽通过哺乳和直接饮水接触铅。在幼崽生后1d(P1),8d(P8),15d(P15),22d(P22),30d(P30)将其分别处死,取出脑组织。采用犤γ-32P犦ATP放射性磷标记法于体外测定铅暴露小鼠大脑组织的PKc的活性;另外取暴露于不同浓度醋酸铅的发育期小鼠,通过被动回避反应实验进行记忆行为学训练和测试,观察不同浓度的铅对小鼠记忆的影响。主要观察指标:①不同浓度铅暴露对发育期小鼠大脑组织内PKc活性的影响。②不同浓度铅暴露对发育期小鼠记忆行为的影响。结果:对幼鼠脑PKc的活性测定显示:在发育初期铅暴露小鼠脑中PKc活性高于正常,发育后期则低于正常,高浓度铅对PKc活性抑制较强;记忆行为学测试可见低浓度铅使小鼠发育初期记忆曲线升高,而使中长期记忆曲线减低;铅浓度升高,记忆曲线降低。

摘要：背景:转录因子NF-E2相关因子2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子,有实验表明转录因子NF-E2相关因子2能被蛋白激酶c家族中的众多成员磷酸化,为进一步研究微波辐射造成氧化应激损伤的产生机制,是否可以从转录因子NF-E2相关因子2途径观察微波辐照对抗氧化调控系统的影响?目的:分析微波辐照对血管内皮细胞转录因子NF-E2相关因子2的磷酸化及蛋白激酶c活性的影响。设计:观察对比实验。单位:解放军第三军医大学劳动卫生学教研室。材料:血管内皮细胞株,H332PO4,Protein-A Sepharose(Sigma公司),转录因子NF-E2相关因子2单抗(H-300,Santa cruz),蛋白激酶cα单抗(Santa cruz),玻纤滤膜(Whatman公司)凝胶扫描系统(Gel Doc 2000,Bio-Rad),液闪测定仪(LKB-117瑞典)。方法:实验于2003-03/07在解放军第三军医大学劳动卫生学教研室电磁辐射生物效应研究室完成。①转录因子NF-E2相关因子2磷酸化分析:血管内皮细胞以DMEM培养液培养至细胞生长至旺盛期,加入32Pi孵育标记2h,将细胞培养瓶置于37℃水浴盒中,在反射系数近似零的微波暗室接受微波辐照,为辐照组,辐照平均功率密度为30mW/cm2,辐照时间30min;以未接受辐照的细胞为对照组。采用免疫共沉淀-放射自显影法测定转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平,用凝胶扫描系统对细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平进行半定量分析,对照组细胞直接进行分析。②蛋白激酶c蛋白激酶活性分析及表达量测定:辐照组及对照组细胞培养方法、条件,辐照方式、剂量、条件同前。于辐照后2,4,8,24h裂解细胞,提取胞浆和胞膜蛋白,采用r-32P-ATP标记液闪法进行蛋白激酶c活性测定;采用凝胶扫描系统对蛋白条带灰度进行半定量分析;对细胞进行蛋白激酶c免疫细胞化学染色后于光镜下观察细胞胞浆的着色程度,对照组均直接给予测定和观察。主要观察指标:①辐照组及对照组转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平检测结果。②细胞蛋白激酶活性分析及表达量测定结果。结果:①辐照组及对照组转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平测定结果:辐照组辐照后2,4,8h,转录因子NF-E2相关因子2条带灰度强于对照组细胞,辐照4h,转录因子NF-E2相关因子2磷酸化达到峰值水平,条带灰度扫描半定量分析显示辐照2,4,8h辐照组细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平较对照组分别增加33%,261%,141%(t=2.974,4.209,4.047,P<0.05),24h恢复正常。②辐照组及对照组细胞蛋白激酶c表达量及活性检测结果:微波辐照2,4,8h,辐照组细胞蛋白激酶c表达量高于对照组,以4h最明显,辐照后24h恢复正常;免疫细胞化学染色显示辐照组细胞辐照4h胞浆着色强度强于对照组;r-32P-ATP标记液闪法显示辐照2,4,8h,辐照组细胞蛋白激酶c活性较对照组分别增加了36%,93%,47%(t=2.801,3.654,3.035,P<0.05),24h有回落。蛋白激酶c激活的峰值发生在照射后4h。结论:微波辐照可引起血管内皮细胞转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平在一定时段内增强,同时可引起细胞蛋白激酶c表达增加,其活性变化时间效应与转录因子NF-E2相关因子2磷酸化水平有一致性。

摘要：背景:严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质。烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚。目的:观察烧伤后不同时相点肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的变化及运用特异性调控剂H-7后小鼠腹腔巨噬细胞内核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活性及膜浆蛋白激酶c(proteinkinasec,PKc)的变化,在信号转导的水平探讨PKc是否参与了巨噬细胞TNF-α的调控,阐明巨噬细胞功能紊乱的某些机制。设计:以实验动物为研究对象的随机对照的实验研究。单位:一所军医大学的烧伤研究所。材料:实验于1999-01/12在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成。实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠,32只。方法:以本所小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤。实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48h6组。收集腹腔巨噬细胞。采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,同位素掺入测膜浆PKc活性。主要观察指标:①检测TNF-α的含量。②测定NF-κB的活性。③检测膜浆PKc的活性。结果:烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12h达到高峰,为(1085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.

摘要：背景:预先电刺激小脑顶核(fastigialnucleus,FN)具有明确的缺血脑保护作用,但其机制尚不十分清楚。研究缺血诱导的蛋白激酶c(proteinkinasec,PKc)同工酶γ,δ异常表达,可使人们从新的角度去认识和探索预先电刺激FN缺血脑保护作用的机制。目的:观察预刺激脑缺血大鼠小脑顶核不同时相PKc同工酶γ,δ蛋白表达。设计:随机对照实验。地点和对象:实验地点:重庆医科大学神经病学研究所。Wistar雄性大鼠48只,随机将动物分为单纯缺血再灌注组(I/R),假手术组(I/R'),刺激小脑齿状核(dentatenucleus,DN)I/R组(I/RDN),刺激小脑FNI/R组(I/RFN);其中I/RDN,I/RFN又分别分为3组:缺血前1,4,7d刺激。每组动物为6只。干预:采用线栓法大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型,缺血时间均为1.5h再灌注24h;于缺血前1,4,7d分别刺激小脑顶核、齿状核1h。主要观察指标:以尾状核冠状切面作为观察对象,应用免疫组织化学方法观察对照组、假手术组、刺激小脑顶核组和齿状核组PKcγ,δ的表达情况。结果:缺血前1,4,7d刺激小脑齿状核各组、单纯缺血再灌注组、假手术组PKcγ,δ阳性细胞数比较无显著性差异(P>0.05),而缺血前1,4,7d预刺激小脑顶核能明显抑制PKcγ,δ蛋白的表达(t=2.372～6.632,P<0.05)。结论:缺血性脑损害能诱导PKcγ,δ蛋白表达上调,?

摘要：目的研究中国仓鼠卵巢上皮细胞是否表达蛋白激酶cδ亚型。方法参照GeneBank数据库PKcδ亚型的cD-NA序列;通过EMBL-EBI数据库的cLUSTALW,选取种属间同源性最高的序列;利用GENERUNNER软件设计PKcδ亚型的特异引物;RT-PcR扩增cHO细胞PKcδ亚型的cDNA序列;利用AT克隆技术将PKcδ连接到pGEM-T载体上,经蓝白斑筛选,酶切鉴定后测序;Westernblotting方法检测cHO细胞中PKcδ亚型。结果运用RT-PcR和Westernblotting技术证实cHO细胞表达PKcδ亚型,并经测序证实。结论cHO细胞中发现PKcδ亚型的存在,为深入研究PKcδ亚型的结构、功能及与细胞内信号转导通路的关系奠定基础。

摘要：蛋白激酶c(PKc)是一组磷脂依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶G(PKG)共同构成丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGc超家族。PKc包括传统型PKc、新型PKc、非典型PKc和与PKc相关的一些激酶(PRK)成员。PKc广泛分布于哺乳动物的组织和细胞中,对细胞的生长代谢、增殖分化等起着重要的生物学作用。研究表明,多种细胞的变异和疾病的发生发展都与PKc的异常表达有关。因此,设计和寻找高效的PKc抑制剂对于多种有效药物的合成和临床上包括肿瘤、心血管疾病、高血压等多种疾病的治疗都具有非常重要的意义。近年来,关于PKc抑制剂的研究已经成为国内外研究的焦点。大量文献报道了多种有效的PKc抑制剂,并对其作用位点、作用机制以及临床试验数据等进行了分析。这些PKc抑制剂的发现对于PKc的结构分析和疾病的治疗具有重要的意义。因此,本文对这些高效的PKc抑制剂进行综述。

摘要：蛋白激酶c(PKc)抑制剂对抗肿瘤、抗病毒、治疗心血管疾病等多种药物的合理设计有着非常重要的意义。该文对文献报道的天然产物中的PKc抑制剂依据化学结构进行分类,并对其生物来源、生物活性和作用位点进行综述。