摘要：背景:近年来研究认为,胃黏膜损伤修复过程有多条信号转导通路参与,并与蛋白质广泛的发生磷酸化与去磷酸化有关,多个实验均从单个通路的角度验证这些观点。目的:课题组设计了全面、动态、定量观察电针足阳明胃经(穴)大鼠胃黏膜修复过程中是否有多个通路的参与的方案,并应用蛋白芯片技术观察相关蛋白磷酸化信号转导通路的多途径变化情况。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-11/2008-01在湖南中医药大学实验动物室和国家中医药管理局三级实验室、经穴与脏腑相关重点研究室完成。材料:健康雄性SD大鼠20只,随机选15只用无水乙醇灌胃法制备胃黏膜损伤大鼠模型,剩余5只为空白对照。方法:①空白组与模型组每天只捆绑不针刺。②针刺治疗组针刺大鼠双侧足三里、梁门、四白穴,接上G6805治疗仪,疏密波,频率4/50Hz,输出电压2～4V,强度以肢体轻微颤抖为度,30min/次,1次/d,连续7d。③针刺对照组则在同一时间针刺双侧的足三里、梁门、四白穴内侧约0.3cm的非经非穴点,其余的处理均同治疗对照组。主要观察指标:参照GUTH法行胃黏膜损伤指数;各组间上下调(磷酸化水平变化≥1.5倍)蛋白的归属通路的比较。结果:①模型组胃黏膜损伤指数高于空白组(P<0.01);针刺治疗组胃黏膜损伤指数值显著低于模型组和针刺对照组(P<0.01),而与空白组比较差异无显著性意义。②蛋白芯片分析示:针刺治疗组与针刺对照组均可上调或下调模型组的蛋白磷酸化的水平(≥1.5倍)。针刺治疗组与针刺对照组差异通路比较,磷酸化水平上调1.5倍蛋白中,针刺治疗组激活了6条通路,而针刺对照组只激活了5条通路,其中针刺对照组MAPKS通路缺如,磷酸化水平下调1.5倍蛋白中,针刺治疗组激活了3条通路,而针刺对照组只激活了一条通路,且无同名通路。结论:电针足阳明胃经(穴)修复胃黏膜引起大鼠胃黏膜损伤后修复信号蛋白的多个信号通路的激活,提示电针促胃黏膜修复机制是一个多通路、多水平的调节过程,其修复过程也是多通路、多靶点、多途径共同作用的结果。

摘要：目的了解大肠埃希菌临床菌株超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因及其携带模式、β-内酰胺类抗生素诱导以及组氨酸激酶抑制剂抑制细菌蛋白磷酸化和ESBLs基因表达的作用机制。方法采用PCR和测序法确定大肠埃希菌主要ESBLs基因（KPC、TEM、SHV、CTX-M）及其携带模式。采用E-test和微量试管稀释法分别测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。采用固定化金属螯合层析法、细菌蛋白磷酸化检测试剂盒及实时荧光定量RT-PCR分别检测1／4MIC青霉素和头孢噻肟诱导或组氨酸激酶抑制剂（氯氰碘柳胺、自行设计的溴化或碘化甲基咪唑）抑制大肠埃希菌耐药菌株蛋白磷酸化和ESBLs基因mRNA水平升高的作用。结果183株β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株中，TEM和CTX-M基因检出率（83．1％和77．1％）高于其他基因且以两者同时携带模式为主（65．0％）（P〈0．05）。1／4MIC青霉素和头孢噻肟钠能诱导大肠埃希菌耐药菌株蛋白磷酸化及TEM、SHV、CTX—M基因mRNA水平显著升高（P〈0．05）。200μmol氯氰碘柳胺、2或10μmol溴化甲基咪唑、20或50μmol碘化甲基咪唑无抑制或杀灭大肠埃希菌的作用，但能抑制上述抗生素诱导的细菌蛋白磷酸化和ESBLs基因mRNA水平升高（P〈0．05），也能提高大肠埃希菌耐药菌株对青霉素和头孢噻肟的敏感性（P〈0．05）。结论TEM和CTX—M是本地区β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株优势ESBLs基因，TEM＋CTX-M是ESBLs基因优势携带模式。亚致死量β内酰胺类抗生素可经TCSS上调大肠埃希菌ESBLs基因表达水平，但可被组氨酸激酶抑制剂所抑制。

摘要：目的研究纹状体蛋白质酪氨酸磷酸酶(STEP)pY-loop结构上第330位的苏氨酸(T330)和Q-loop结构上第541位的苏氨酸(T541)参与催化反应的作用机制。方法构建STEP野生型(STEP-WT)及其突变体(STEPT330D/T541A)的表达质粒;表达并纯化STEP-WT及其突变体蛋白,体外检测这些蛋白对小分子底物4-硝基苯磷酸二钠(pNPP)的催化活力,分析NaVO3对STEP-WT及其突变体酶活性的抑制作用;检测STEP-WT及其突变体催化反应的pH依赖性和对解离基团pK a的依赖性。结果体外催化pNPP水解的过程中,STEP-T330D的催化性质较STEP-WT无明显变化,STEP-T541A的K m略有增加,k cat下降至STEP-WT的1/3以下。NaVO3对于STEP-WT及其突变体的抑制常数K i无明显变化。在STEP的pH依赖性研究中,STEP-T541A的pK2app显著增加且它的(k cat)lim下降至野生型1/10以下。在STEP催化底物反应过程对底物解离基团pK a依赖性的研究中,STEP-T541A的β1g(k cat)较STEP-WT明显增大。结论 T541参与了STEP催化反应中从产物生成到磷酸根释放这一过程,靶向STEP治疗神经系统疾病的药物可以考虑通过与T541相互作用进行设计。