摘要：光周期是影响植物抽薹开花最重要的环境因子之一,光周期信号通过植物的光敏色素蛋白调控植物的抽薹开花,其中PHYB介导的信号网络对植物抽薹开花有重要的抑制作用。前期研究发现,大白菜耐抽薹材料06-247与易抽薹材料He102的PHYB基因启动子存在大片段插入/缺失差异,为了进一步研究启动子突变对PHYB及其下游途径关键基因的影响,以耐抽臺材料06-247与极易抽臺材料He102为试验材料,采用生物信息法分析了大白菜基因组中光敏色素基因的冗余特点,发现大白菜基因组包含6个光敏色素基因,其中PHYA有2个拷贝,PHYB、PHYC、PHYD和PHYE都仅有1个拷贝。进一步通过氨基酸序列比对筛选出了PHYB的特异序列、设计了抗原决定簇并制备了抗大白菜PHYB的特异抗体,采用荧光定量RT-PCR技术和Western Blot技术研究了06-247与He102中PHYB的相对含量,同时比较了PHYB下游光周期通路关键调控基因CCA1、FLC、CO和FT的动态变化。结果表明:启动子突变造成PHYB在06-247中表达水平显著升高并进而造成PHYB蛋白水平显著升高,同时下游调控基因CCA1、FLC、CO和FT均在06-247中高水平表达,这对06-247的耐抽薹特性有重要影响。

摘要：为了获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)体外诱导表达的MGF360-13L蛋白,试验依据GenBank中报道的MGF360-13L基因序列设计引物,引入His标签,以ASFV全序列为模板扩增目的片段。将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中进行体外诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质的表达情况,将表达的重组蛋白通过镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化,蛋白质印迹(Western-blot)分析蛋白质的活性。结果表明:克隆得到的MGF360-13L基因片段长度为1060 bp,获得的重组蛋白在沉淀中以包涵体的形式表达,分子质量约为60 ku,纯化后可获得纯度较高的MGF360-13L,用BCA法测定最高浓度为2.73 mg/mL。Western-blot检测结果显示在60 ku处有一条明显的特异性条带说明MGF360-13L蛋白可以在BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中表达并纯化,纯化后可获得纯度较高的MGF360-13L,且具有良好的反应原性。

摘要：研究了常压低氧条件下Wistar大鼠脑组织中HIF-1α表达及脑损伤。设计了短期和长期低氧两种模式。短期急性低氧模式中,成年Wistar大鼠被随机分为4组:6%、8%、10%低氧组和常压常氧组。各组在上述氧气浓度条件下暴露2h;长期急性低氧在6%氧气浓度下每天低氧2h、连续低氧暴露10d。使用免疫组织化学和蛋白质印迹方法对低氧诱导因子HIF-1α在模型鼠脑组织内表达进行了表征,考察了低氧暴露强度、抗体稀释度对低氧诱导因子HIF-1α表达的影响;并应用HE染色法对脑组织的病理损伤进行了研究。实验结果证实,HIF-1α属于对低氧环境敏感的、低丰度的DNA结合蛋白,表达于脑组织核蛋白提取液中。高的低氧暴露强度和较低的一抗稀释度有利于HIF-1α表征。HE染色表明经6%急性低氧暴露2h处理后,模型鼠脑组织有损伤,海马神经细胞出现散在性单个坏死现象。

摘要：目的构建粉尘螨6类变应原(Dermatophagoides farinae,Derf6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据Derf6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Derf6基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌(***10),经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Derf6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,经纯化后连接并转化至***10。构建的重组质粒pET24a-Derf6经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至***21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Derf6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Derf6和pET24a-Derf6。SDS-PAGE结果表明Derf6基因在***21(DE3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(Mr)为31000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Westernblotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Derf6。

摘要：将编码大连蛇岛蝮蛇类凝血酶 (Gloshedobin)的基因克隆于表达载体pET 32a( + )中 ,以融合蛋白形式在大肠杆菌中获得表达。在 2 5℃下经 1mmol LIPTG诱导 6h ,SDS PAGE和蛋白质印迹分析表明 ,部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌的细胞质中。针对金属螯合亲和层析分离某些含His 标签重组蛋白质时专一性不高 ,并且存在配基泄漏的缺陷 ,设计合成了以抗重组类凝血酶的鸡卵黄免疫球蛋白为配基的免疫亲和层析柱。通过疏水色谱OctylSepharoseFF ,IgY免疫亲和层析以及强阴离子交换色谱SourceQ等三步柱色谱分离纯化获得比活力为 45 4 7U mg的重组蛇毒类凝血酶 ,活力回收率为 34 8%。蛋白质印迹分析和纤维蛋白原凝结活性分析表明 。

摘要：目的:以乙酰肝素酶(HPA)基因为靶点,构建短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,研究慢病毒携带的sh RNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用。方法:以乳腺癌HPA基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,通过构建3对sh RNA重组慢病毒的表达载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,在体外采用蛋白质印迹(Western blot)法检测HPA基因蛋白表达水平;在体内构建乳腺癌模型,通过免疫组化检测HPA基因蛋白的表达。结果:在体外实验中,HPAsh RNA-1组和HPA-sh RNA-2组均有效抑制了人乳腺癌MDA-MB-231细胞HPA的表达。在体内实验中,HPA-sh RNA-2组HPA基因蛋白的表达明显低于阴性对照组及空白对照组,HPAsh RNA-2组阳性率与空白对照组比较,差异有统计学意义(x2=12.504,P<0.05)。表明在体内实验中HPA-sh RNA-2组可以下调HPA基因蛋白表达。结论:以HPA为靶点构建sh RNA重组慢病毒载体,体内外实验均能下调乳腺癌HPA基因的表达,可为乳腺癌靶向治疗提供新的靶点。

摘要：以谷氨酰胺合成酶(GS)同工酶表达为线索进行生物化学实验系列化教学,可以做到以点带面、以点突破、从点上深入。该项实验内容的完成有利于使学生既能学习并掌握生物化学的一些基本的实验方法和技术,包括蛋白质水平、酶活性、酶动力学、同工酶测定,不同类型的电泳和目标蛋白的检测等生命科学研究中的一些常用的和较先进的方法和技术,又可以培养学生的动手能力、分析问题和解决问题的能力,培养学生的科学研究意识,引导学生学习科学研究的思维方式,学习设计较理想的科学研究方案,有利于学生科学研究能力的培养。