摘要：蛹虫草是一种珍稀的药食两用真菌,为提高其菌丝体的液体发酵效率,首先通过单因素试验确定了蛹虫草液体发酵的最优碳源、氮源及适宜培养的pH、温度、装液量和转速6个因素。然后采用Plackett-Burman试验设计,确定葡萄糖、牛肉膏、温度是影响蛹虫草液体发酵菌丝体生物量的关键因素。利用响应面法设计三因素三水平试验,最终获得蛹虫草菌丝体液体发酵的最佳配方及条件为:牛肉膏13.34g/L、葡萄糖20.00g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO41.5 g/L,pH 6.5,摇床转速150 r/min,温度27℃。验证试验表明,优化后条件培养的菌丝生物量可达1.489 g/105 mL,是优化前的2倍,与模型预测值基本一致,优化效果较好,可为蛹虫草液体深层发酵培养及后续工厂化生产提供技术参考。

摘要：以蛹虫草菌株W5继代培养(8 d转接1代)1~5代菌株(W5-1~W5-5)为研究对象,观察蛹虫草继代培养过程中菌落形态、细胞超微结构和活性氧含量的变化,以期揭示继代培养过程中蛹虫草菌株退化的早期外部识别标志。结果表明:蛹虫草W5菌株退化是个渐变的过程,继代培养至3代菌落形态、菌丝和孢子形态开始出现变化,节律环和颜色变化以及菌丝表面的缢裂和凹陷是3代的显著外部特征,可作为蛹虫草菌株退化的早期菌落形态识别标志。在蛹虫草W5菌株继代培养过程中,菌丝的细胞壁逐渐变薄,细胞核逐渐变大,线粒体逐渐肿胀变形,液泡逐渐增大,膜边体逐渐减少,圆球体逐渐溶解,形成脂滴和嗜锇颗粒。可以通过细胞中核仁是否显现、有无膜边体、有无液泡融合和自噬现象来早期判断菌株的退化程度。从3代开始菌丝细胞NBT染色颜色逐渐加深,反映细胞活性氧含量增加。细胞H_(2)O_(2)含量测定表明,3代H_(2)O_(2)含量显著高于前2代。基于线粒体与活性氧的紧密关系,认为线粒体结构和数量上的改变可能是蛹虫草退化的重要原因之一。

摘要：以蛹虫草子实体为原料,采用响应面设计优化蛹虫草多酚提取工艺,分析蛹虫草多酚的抗氧化活性。以多酚的得率为指标,在单因素试验基础上,利用Box-Behnken设计进行响应面试验,确定蛹虫草多酚最佳提取工艺,并对多酚体外总抗氧化能力及DPPH自由基、羟自由基清除能力进行分析。结果显示:蛹虫草多酚最佳提取工艺为提取温度51℃、提取时间1.6 h、液料比49∶1(mL/g),优化条件下多酚得率为6.03 mg/g。抗氧化活性分析结果表明:浓度为0~0.4 mg/mL时,蛹虫草多酚总抗氧化能力随着质量浓度的增加而增强,且始终高于同等浓度的维生素C溶液;多酚溶液对DPPH自由基的半抑制质量浓度为19.52μg/mL,为维生素C溶液的75.25%;对羟自由基半抑制质量浓度为86.47μg/mL,是维生素C溶液的8.31%。蛹虫草多酚的提取工艺可行,蛹虫草多酚具有较强的抗氧化活性。

摘要：传统的真菌遗传改造方法需要抗性标记,但目前可使用的抗性标记基因非常有限,导致蛹虫草遗传改造面临着抗性基因数量不足的问题,且尚未能实现多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究利用CRISPR/Cas9技术对蛹虫草的Cmura5基因进行编辑,通过内源5S-1、5S-2和U6启动子对gRNA进行转录,结果表明使用U6启动子对Cmura5基因的编辑效率达到了100%。在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5–中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即野生型菌株可以在基础培养基上生长。利用设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。以尿嘧啶缺陷型Cmura5–为出发菌株,利用无抗性标记转化技术,导入一个重组质粒效率为75%;连续导入2个重组质粒效率为80%;连续导入3个重组质粒效率为100%;连续导入4个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达。

摘要：以蛹虫草为试材,以虫草素含量为评价指标,在单因素试验的基础上,采用响应面设计试验优化添加抗氧化剂后的蛹虫草液体发酵条件,并对发酵体系中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)活性进行测定,研究了抗氧化剂的加入对发酵体系代谢的影响,以期提高蛹虫草液体发酵虫草素产量,并对抗氧化物质的加入与关键氧化还原酶活性及菌体形态的关系进行初步探究。结果表明:选择Na_(2)SO_(3)作为抗氧化添加物,发酵时间定为28 d,响应面试验得到最佳发酵条件为Na_(2)SO_(3)添加量10.2 mg·mL^(-1)、发酵温度24.3℃、初始pH 7.78,发酵得到胞外虫草素产量1188.165μg·mL^(-1),增加达55.16%;添加Na_(2)SO_(3)使SOD、GSH-Px活性显著增强,其中GSH-Px活性增加达47.51%;此外,扫描电镜显示该条件下,菌体形态发生明显改变,内部结构由疏松多孔变得致密。初步证明加入抗氧化物质能够调节发酵体系氧化应激进而影响虫草素代谢。

摘要：蛹虫草作为一种新食品原料,富含水溶性的新型类胡萝卜素。以蛹虫草子实体为原料,筛选一种安全的提取溶剂和无环境污染的细胞破碎方法,以获得类胡萝卜素的最适提取工艺参数。以类胡萝卜素得率为指标,采用7种溶剂分别提取类胡萝卜素,最终确定乙醇溶液为最适提取溶剂。分别采用超声波破碎法和酸热法提取类胡萝卜素,结果表明超声波破碎法较酸热法更有利于类胡萝卜素的提取。在单因素试验基础上,选取乙醇浓度、提取时间、提取温度为自变量,采用Box-Behnken试验设计建立回归模型,获得了类胡萝卜素的最适提取工艺参数为乙醇体积分数73.4%,提取时间30.4 min,提取温度54.4℃。在此条件下,类胡萝卜素得率的预测值为2969.23μg/g,验证试验的试验值为3017.31μg/g,预测值和试验值差异不显著,回归模型拟合程度良好。

摘要：目的:类胡萝卜素双加氧裂解酶(CCD)是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶。旨在鉴定并克隆蛹虫草中的CCD酶,通过相关生物信息学分析和荧光定量PCR探究其结构、功能聚类以及表达调控。方法:用GenBank登录的CCD酶基因序列与蛹虫草基因组比对,在保守区域设计1对引物,以蛹虫草基因组的DNA为模板对CCD酶基因进行扩增,扩增产物命名为car-TC。car-TC基因连接载体后由生物公司测序;序列通过多种生物信息学软件和在线工具分析;表达量随生长情况的变化关系通过实时荧光定量PCR进行测定。结果:克隆了car-TC基因,该基因长1784bp,编码一个577aa的蛋白质,该蛋白质含有CCD酶活性必需的4个组氨酸残基,系统发育进化分析表明该蛋白和棒束菌、白僵菌的同源蛋白聚在同一簇,实时荧光定量PCR结果表明该蛋白的表达量随生长时间的延长而减少。结论:获得一个类胡萝卜素合成途径中的关键酶——双加氧裂解酶基因car-TC,该基因的表达主要受时序调控,随生活周期的进行有逐渐降低的趋势。

摘要：为探究蛹虫草液体发酵培养基及其抗氧化活性,以蛹虫草生物量为指标,在单因素试验基础上,通过响应面设计方法对蛹虫草液体发酵培养基进行优化.结果表明:蛹虫草液体培养基的最优配方为蔗糖32 g·L^(-1),蛋白胨6 g·L^(-1),酵母粉4 g·L^(-1),在此条件下,蛹虫草菌丝生长良好,蛹虫草生物量为2.41 g,接近理论值(2.37 g).蛹虫草菌丝体具有一定的体外抗氧化能力,具有清除DPPH自由基和ABTS自由基的作用.

摘要：蓝光是很重要的环境因素,可以引起生物体的生理和生化变化;而组氨酸激酶为许多生物体中双组分信号转导系统的重要成分.为了研究蓝光对真菌蛹虫草组氨酸激酶基因(Cordyceps militaris Histidine Kinase,CmHK)表达的影响,从真菌蛹虫草中提取总RNA,设计引物并通过RT-PCR获得蛹虫草CmHK基因的ORF序列,同时进行该基因的序列分析.并应用real-time PCR方法分析检测不同时间蓝光照射下蛹虫草菌丝体中CmHK基因的转录情况.结果获得了CmHK基因的ORF序列.对该基因蛋白质翻译产物CmHK进行的生物信息学分析表明,其中存在着4个HAMP功能域、1个HisKA功能域、1个HATPase功能域和1个REC功能域.将蛹虫草菌丝体进行持续的24 h蓝光照射,采用real-time PCR分析期间的CmHK基因表达,在蓝光照射之初CmHK基因的表达量有明显的下降,随后在蓝光持续的照射下有一个震荡上升,并在16 h时达到高峰,随后快速下降.研究表明蛹虫草的CmHK带有典型的组氨酸激酶特征,蓝光的直接照射可以导致CmHK基因表达水平的改变.

摘要：微胶囊是近年来在保健食品领域应用较广的技术,而乳化-固化法是制备具有生物降解性天然高分子微胶囊的途径之一,操作简便,成本低。本研究以腺苷的包埋率为指标,利用正交试验设计,优化乳化-固化法制备蛹虫草微胶囊工艺。结果表明,当壁材比(抗性淀粉/海藻酸钠,W/V)为1.5%、芯壁比(蛹虫草提取液/海藻酸钠,V/V)为1∶200、转速为2000 r·min^(-1)、氯化钙用量(海藻酸钠/氯化钙,V/V)为20∶11和乳化时间为70 min时,功效成分的包埋率最高,且微胶囊成品的外观形貌良好。研究成果的应用,可为保健食品缓释制剂产业的发展提供技术支持。