摘要：目的:优化蜡样芽孢杆菌发酵生产新型中性蛋白酶的培养条件。方法:采用Plackett-Burman试验设计,筛选影响蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶酶活力的关键因子;通过Box-Behnken响应面试验设计获得新型中性蛋白酶发酵的最佳工艺条件。结果:筛选出影响蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶的主要因子为葡萄糖、蛋白胨和pH值。获得的最优化发酵培养基组成和培养条件:葡萄糖35 g/L,蛋白40.38 g/L,氯化钠15 g/L,硫酸镁1.5 g/L,Tween-8010 g/L,装液量50 mL/250 mL,pH 7.15,菌龄12 h,发酵时间36 h。在上述条件下,蜡样芽孢杆菌发酵生产新型中性蛋白酶的酶活力高达696.51 U/mL,是未优化前的1.93倍。结论:研究结果为新型中性蛋白酶的产业化生产和应用提供了良好基础。

摘要：以蜡样芽孢杆菌gyrB基因作为目标基因并设计特异性引物,用95℃预变性5 min、95℃变性15 s、50℃复性30 s、72℃延伸30 s,反应45个循环为反应程序,以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量聚合酶链式反应(PCR),提出了食品中蜡样芽孢杆菌快速检测的方法,并对该方法特异性、蜡样芽孢杆菌DNA灵敏度以及活菌检出限进行验证。结果表明,该引物在分段扩增中可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测,而且重复性好;以3种非蜡样芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌进行特异性试验,非蜡样芽孢杆菌均没有扩增出曲线,仅蜡样芽孢杆菌扩增出特异性曲线;蜡样芽孢杆菌DNA按10倍稀释法进行灵敏度检测,可达0.01 mg·L^(-1),活菌检出限为8.9×10^(2)CFU·mL^(-1)。

摘要：为建立简单快速的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)的分子分型方法,该研究以*** 63303的基因组DNA为模板,并采用正交设计L16(45)对影响ERIC-PCR反应体系的五个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物)在四个浓度水平上进行优化,并通过单因素试验确定最佳退火温度,最后以优化后的反应体系对50株***分离株进行ERIC-PCR分子分型和聚类分析验证其稳定性和分型效果。结果显示应用建立的ERIC-PCR反应体系对50株分离株扩增均得到了9-17条、大小在200-4000 bp之间的条带,并可将其分为47个型,且分辨力达到0.996,具有较高稳定性和分辨能力。表明ERIC-PCR技术对***分型,具有简便和分辨力高等优点,可用于食源性***分离株的多样性研究。

摘要：该研究以蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的基因组为模板,利用比较基因组学方法筛选并通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证获得3个蜡样芽孢杆菌的特异性基因,用于食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测,并对引物的特异性、灵敏度、抗干扰能力和人工污染检测限等进行评价。结果表明,筛选获得的3个基因片段特异性较好。其中以gene2626设计的引物gFA2特异性最好,检测灵敏度可达359. 5 fg/μL。抗干扰评价结果表明在牛肉背景菌群浓度5. 28×10^7CFU/m L和猪肉背景菌群浓度7. 75×10^6CFU/m L的干扰下,蜡样芽孢杆菌的最低检出限为3. 74×10^3CFU/m L。人工污染试验结果表明,蜡样芽孢杆菌经增菌培养10 h后,人工污染的牛肉和猪肉样品中蜡样芽孢杆菌的检出限分别为4. 62和8. 38 CFU/g。因此该研究筛选的特异性基因及建立的PCR检测方法在食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测方面具有一定的应用潜力。

摘要：测定了57种脂肪酸及其衍生物对蜡样芽孢杆菌的最低抑制浓度,并利用结构描述符回归法(SDQSAR)和比较分子立场分析法(Co MFA)研究脂肪酸衍生物的结构与抑菌活性之间的定量关系,获得了预测能力较优的两个模型(SDQSAR:R2=0.881,Q2LOO=0.832;Co MFA:R2=0.835,Q2LOO=0.523)。模型分析结果表明,影响脂肪酸抑菌活性的主要因素为立体效应和电性特征;原子排布较密,空间体积在一定范围,某些位置没有大的立体位阻,羧基、酯基端电负性强,特定的电子云排布和对外电场较敏感的脂肪酸分子更易具有较强抑菌能力。研究获得的QSAR模型可用于指导新型高效脂肪酸衍生物抑菌剂的设计,减小设计合成工作量,提高成功的可能性。

摘要：本文旨在建立一种生长/非生长界面模型来预测蜡样芽胞杆菌在环境因子交互作用下的生长概率。选取五株蜡样芽孢杆菌菌株的混合菌株作为研究对象,研究温度、pH、Aw对混合菌株生长概率的交互影响。获得的生长/非生长实验数据用logistic回归方程拟合,建立了环境因子交互作用下蜡样芽孢杆菌生长/非生长界面模型。实验采取部分析因设计方案,选定80%的实验数据用做模型的拟合,20%的数据用做模型的验证。并从已发表的文献中选取30个数据作为测试集,通过比较预测值和观察值来检测已建模型的适用度。实验结果表明,训练集的一致性指数为0.991,验证集的一致率为0.988,说明模型对同类数据预测准确度高;同时模型的R2-Nagelkerke值也较高,为0.949;Hosmer-Lemeshow检验中的χ2=0.012,P=1,logistic回归模型拟合度较高。模型对测试集的预测准确率达83.3%,该模型对所选数据具有较高的预测能力,说明模型具有较广的适用范围。

摘要：目的分别对非溶血性肠毒素基因(Nhe)的3个亚基进行原核表达,并对蜡样芽孢杆菌分泌的非溶血性肠毒素蛋白进行免疫学鉴定。方法根据NCBI数据库非溶血性肠毒素NheA、NheB、NheC基因序列设计引物,以蜡样芽孢杆菌的基因组为模板,PCR扩增NheA、NheB、NheC基因。分别将3个基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化到大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析以及Western blot分析,并免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组表达载体分别转化至BL21(DE3),经IPTG诱导表达相应的目的蛋白,分子质量单位分别为NheA 40ku,NheB 44ku,NheC 40ku。经电离飞行时间质谱鉴定,重组蛋白NheA、NheB和NheC表达正确。3种目的蛋白经SDS-PAGE电泳后分别割胶回收,免疫新西兰大白兔,获得重组多克隆抗体。结论成功构建了NheA、NheB、NheC基因重组表达载体,表达的重组蛋白免疫新西兰兔获得相应的克隆抗体,为进一步研究非溶血型肠毒素的结构和功能奠定了基础。

摘要：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在自然界中广泛存在,而且大部分菌株能产生肠毒素和呕吐毒素,是引起养殖动物中毒的常见致病菌。在饲料生产过程中,为对该病原菌进行有效监控,以蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(entFM)和肠毒素T基因(bceT)保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计两对特异性引物,建立一种基于实时荧光PCR(real-time PCR)技术的蜡样芽孢杆菌快速检测方法,并对所建立方法的重复性、特异性及灵敏度进行分析。结果表明:所设计的引物可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测而且具有较高的重复性;对8株蜡样芽孢杆菌和8株非蜡样芽孢杆菌共16株菌株进行特异性检测,8株蜡样芽孢杆菌检测全部为阳性,8株非蜡样芽孢杆菌检测全部为阴性,无漏检和误检现象;对纯培养条件下蜡样芽孢杆菌提取的DNA模板进行10倍梯度稀释并进行灵敏度检测,两种肠毒素基因的检测限均为1.0×104CFU·mL^-1;对人工染菌的饲料样品进行检测,在增菌18~20h后进行实时荧光PCR检测,检测限均可达到10CFU·mL^-1,证明该方法具有良好的特异性和灵敏度,是快速检测饲料中蜡样芽孢杆菌的有效方法。

摘要：建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

摘要：目的对经API细菌鉴定条所证实的眼源性蜡样芽孢杆菌进行溶血素BL（HBL）基因鉴定并进行体外毒理性试验。方法根据溶血素结合亚基B、2个溶血亚基L1、L2三种组分的基因核苷酸序列，设计合成3对特异性引物，通过体系和条件优化，建立PCR检测方法，并对5株临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌进行检测分析；随机选取其中1株菌，利用盐析法提取溶血素，并以不同浓度剂量作用于绵羊红细胞、Vero细胞和Hela细胞，监测其对细胞的毒性；通过腹腔注射观察HBL对小鼠的致死作用，评估其毒力的强弱。结果5株临床分离菌中，共检出3个基因；蜡样芽孢杆菌溶血素BL蛋白具有较强溶血活性，其溶血活性呈明显的时间一剂量依赖性；BL溶血素对Vero细胞和Hela细胞的作用所致的形态变化虽有不同，但结果均导致细胞死亡，其内容物释出；对小鼠的致死率同样存在时间-剂量依赖性，且2．0HU／ml浓度以上的BL溶血素可使小鼠48h的致死率达100％。结论HBL具有较强的溶血活性，对临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌BL基因进行检测，3个基因均表达，为该菌感染后病情发展迅速、预后较差的临床表现提供了理论依据，同时为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的方法。