摘要：目的:基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。方方法法:煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。结果:蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg·L^(-1),纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100μL胶体金溶液加入3.3μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g·L^(-1),检测线浓度为1 g·L^(-1)时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6μL,样品展开液100μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^(-3)mg·L^(-1)仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10-1mg·L^(-1)出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。结论:建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。

摘要：目的:基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。方法:煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。结果:煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^(-1),纯度为1.50~1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^(-1)mg·L^(-1);稳定性检测,多重PCR体系自制备起每6个月检测稳定性一致。结论:建立的多重PCR检测体系对于蜡样芽胞杆菌nhe499、cytK191和entFM363 3种毒素基因灵敏度高、特异性强,检测结果准确稳定,检测体系具有良好稳定性,适用于快速检出蜡样芽胞杆菌的3种不同致病毒素基因。

摘要：为实现简便快速地检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),根据Gen Bank中蜡样芽胞杆菌16 S RNA序列设计特异性引物和exo探针,建立了一种实时荧光重组酶聚合酶扩增方法,在39℃恒温下仅需20 min即可完成检测。该方法特异性扩增蜡样芽胞杆菌16 S RNA基因片段,对其他芽胞杆菌和非芽胞杆菌无扩增;以蜡样芽胞杆菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.0×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染实验表明,当大米饭中蜡样芽胞杆菌污染量≥1.5×104CFU/g时,即可通过real-time RPA方法检出,所需时间仅为6~13min;而当污染量≥1.5×105CFU/g时,才能通过real-time PCR方法检出,所需时间至少为30 min(Ct值为20~31)。

摘要：目的:建立一种快速、准确、简便的蜡样芽胞杆菌毒力基因检测方法,为蜡样芽胞杆菌更深入的研究提供依据和便利。方法:采用Taq Man探针法设计了三重hbl A,hbl C,hbl D基因,三重nhe A,nhe B,nhe C基因,三重ces,ent FM,bce T基因的多重实时荧光PCR体系检测蜡样芽胞杆菌毒力基因。结果:多重体系对蜡样芽胞杆菌毒力基因的检测具有良好的特异性和灵敏性,其最低检出限为63 CFU/m L。结论:利用上述体系对蜡样芽胞杆菌的毒力基因进行检测能够省时省力,特异性、灵敏性良好,具有实际应用价值。

摘要：采用PCR技术,通过扩增蜡样芽胞杆菌的gyrB基因来实现对蜡样芽胞杆菌的快速检测。结果表明,以gyrB为目的基因设计引物建立的PCR检测方法能特异性地扩增出蜡样芽胞杆菌,且与其他芽胞杆菌菌株均无交叉反应,其检测敏感性可达9 cfu/mL,能够应用于蜡样芽胞杆菌的鉴定。

摘要：全球每年可产生的纤维素数量庞大。为了探索纤维素资源,更为科学合理的利用纤维素类饲料提供理论依据,根据蜡样芽胞杆菌纤维素酶基因序列设计1对特异性引物,扩增纤维素酶(Cell)基因,获得片段大小约为1 269bp的目的基因。该基因与Bacillus cereus B4264、Bacillus cereus G9842纤维素酶基因序列同源性分别达96%和95%。将Cell基因与乳酸乳球菌表达载体pNZ8149进行连接,电转化入乳酸菌NZ3900中,构建纤维素高效分解基因工程乳酸菌,经乳链菌肽(Nisin)诱导表达,SDS-PAGE分析得到分子量大小约为42kDa的目的片段。刚果红平板验证该表达蛋白具有纤维分解活性。FPA法测定表达产物酶活力为0.57U/mL。该基因的成功表达,对纤维素基因工程菌的相关研究具有指导意义。

摘要：根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。

摘要：目的建立一种快速、灵敏、特异的眼源性蜡样芽胞杆菌PCR检测方法,为蜡样芽胞杆菌性眼内炎患者的快速诊断提供依据。方法选择编码蜡样芽胞杆菌细胞毒素的cytK为靶基因设计引物,建立检测眼源性蜡样芽胞杆菌PCR;PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,基因序列与GenBank比对验证扩增产物;将计数过的5株蜡样芽胞杆菌菌悬液,梯度稀释后分别提取DNA进行PCR扩增,确定检测方法的灵敏度;分别用眼部常见感染菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、化脓性链球菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌和白假丝酵母菌以及枯草芽胞杆菌DNA进行特异性试验;进一步将该方法应用到人工污染致病蜡样芽胞杆菌的房水标本中,并分析其灵敏度。结果 5株分离自眼内炎患者标本中的蜡样芽胞杆菌均扩增出360 bp左右的DNA片段,测序结果与GenBank比对一致;该法检测在5 h内完成,方法灵敏度达7.5～15.0 CFU/mL;其他菌株检测未出现非特异性扩增;对模拟感染房水标本的PCR鉴定结果与分离培养对比,二者符合率为100%,模拟标本的检测灵敏度与纯菌结果一致。结论 cytK基因为靶基因的PCR用于眼源性蜡样芽胞杆菌的快速检测,具有简便、快速、敏感、特异等特点,为眼内炎患者的快速诊断提供依据,在实际检验工作中有良好的应用前景。

摘要：目的建立多重PCR方法检测蜡样芽胞杆菌。方法根据蜡样芽胞杆菌(***)的hbl A、hbl C、nhe A、nhe B、cyt K、cer、ent FM、bce T基因和苏云金芽胞杆菌(***)的cry基因设计引物,优化反应条件。应用单一引物PCR和国标法对多重PCR反应结果进行确认。结果蜡样芽胞杆菌溶血性基因hbl A和hbl C检出率为57.5%和25.0%,非溶血性基因nhe A、nhe B检出率分别为75.0%和80.0%,细胞毒素cyt K基因检出率为37.5%。肠毒素ent FM和bce T检出率分别为28.7%和18.7%。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌cer基因检出率分别为97.5%和100.0%,cry基因检出率为分别为0.0%和100.0%。cer基因和cry基因同时检测,条带区分清晰,可作为蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴别的首选方法。结论三重PCR结果非常好,三对引物所扩增出的DNA条带明显区分开,电泳条带清晰,敏感度高,特异性强。单重PCR和三重PCR检测结果没有显著性差异。

摘要：目的采用Luminex液相悬浮芯片检测方法,建立一管同时检测19种葡萄球菌肠毒素和蜡样芽胞杆菌肠毒素的快速筛查方法。方法根据GenBank公布的葡萄球菌肠毒素entA-entR基因、蜡样芽胞杆菌cesB,nheB基因,设计特异性引物和探针,优化反应体系和条件,建立19种肠毒素的Luminex液相悬浮芯片检测法。结果 Luminex液相悬浮芯片体系检测19种肠毒素互不干扰,经验证80株金葡菌和蜡样芽胞杆菌菌株,均出现特异性荧光中值信号。Lu minex液相悬浮芯片技术从样品处理到检测结果需3.5h左右。结论 Luminex液相悬浮芯片筛查方法可应用于食物中毒等应急检测的快速和高通量筛查。