摘要：目的原核表达、纯化蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1),并评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)临床诊断中的应用价值。方法根据GenBank登录的TBEV“森张”株NS1基因序列设计引物,PCR扩增TBEV NS1基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经GST bestarose 4FF亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以重组NS1蛋白为固相抗原,采用间接ELISA法检测临床血清。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65000,表达量为22.1%,主要以包涵体形式存在;纯化蛋白纯度达93%以上,与TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反应原性。采用NS1作为包被抗原的间接ELISA法检测临床血清,特异性为95%,敏感度为100%。结论成功在大肠埃希菌中表达并纯化了TBEV NS1蛋白;作为病毒特异性抗原,经间接ELISA法验证,该蛋白在临床疾病的血清学诊断上具有一定的应用价值。

摘要：通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。

摘要：根据TBEV NS5基因序列设计特异性引物,构建标准品,优化荧光定量PCR的反条件和反应体系,将标准品按10^8~10^1拷贝/μL梯度稀释,建立标准曲线。同时分析其敏感性和特异性,并对155份牛血清样品进行检测验证。结果显示,建立了TBEV基于SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR的检测方法。标准曲线在8个浓度梯度间呈现良好的线性关系,扩增效率为97%,组间和组内变异系数均低于2%且无非特异杂峰。敏感性检测显示,荧光定量检测下限为10^1拷贝/μL,灵敏度比半巢式PCR高10倍。该方法对LCMV、SFTSV及TBEV毒株进行检测,仅TBEV出现特异性扩增。临床样品检测结果显示,荧光定量PCR检出TBEV阳性率为14.2%,比半巢式PCR检测阳性率提高了5.2%,两者检测一致率为63.6%。结果表明,成功建立TBEV基于SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR的检测方法,为蜱传病防控奠定基础。

摘要：目的构建蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)衣壳蛋白(capsid protein,C)原核表达质粒,并以其表达、纯化的C蛋白作为抗原检测临床血清,评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)临床血清学诊断中的应用。方法登录Genbank对TBEV“森张”株C蛋白基因序列设计扩增引物,以PCR扩增C蛋白目的基因并克隆至原核表达载体pET-32a(+)后,构建重组表达质粒pET-32a-C。再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导剂诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以制备的C蛋白作为包被抗原,用间接ELISA分别检测20份TBEV IgG抗体阳性临床血清、10份流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)阳性临床血清及20份阴性血清,并计算检测的特异性和敏感度。结果重组表达质粒pET-32a-C序列测定正确;经12%SDS-PAGE电泳分析,重组C蛋白主要为可溶性蛋白表达;纯化后蛋白纯度>90%,经Western blot鉴定可与TBEV全病毒血清抗体特异性结合。间接ELISA定性检测临床TBE血清,其特异性与敏感度分别为96.7%和95.0%。结论成功构建了TBEV衣壳蛋白重组表达质粒pET-32a-C并在大肠埃希菌中实现诱导表达;表达的重组C蛋白可与TBEV阳性血清特异性结合,在临床疾病的血清学诊断上具有一定的应用价值。

摘要：目的:构建蜱传脑炎病毒TBE-E-D3抗原的融合蛋白原核表达质粒GSTpET-30a(+)/TBE-E-D3,在大肠杆菌中诱导表达并用亲和层析法纯化,以获得特异性诊断抗原。方法:根据目的基因序列设计PCR引物,利用基因克隆技术构建重组质粒,转入大肠杆菌DH5α后经酶切鉴定,将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE分析其表达情况和纯度,间接ELISA法鉴定重组蛋白的特异性和灵敏度。结果:TBE-E-D3基因目的片段以正确的读框插入载体GSTpET-30a(+),通过IPTG诱导在大肠杆菌中正确表达,亲和纯化得到较高纯度的蛋白质;间接ELISA法证明抗原特异性和灵敏度良好,送检的15份阳性患者血清样本中检出10份阳性结果,40份健康人血清样本中检出1份假阳性结果。结论:获得的His-TBE-E-D3融合蛋白具有良好的抗原性,可作为森林脑炎病毒特异性血清学诊断的备选抗原之一。

摘要：蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)是由蜱传播的侵犯人中枢神经系统的重要黄病毒,是蜱传脑炎的病原体。目前针对TBEV感染尚无特异性抗病毒治疗。抗病毒药物的设计可以靶向病毒复制周期的任何阶段。研发抗TBEV药物主要基于抑制病毒入侵和病毒复制两种策略。本文综述靶向病毒入侵、复制、蛋白表达和增殖的抗TBEV药物研究进展。

摘要：目的建立一种等温条件下蜱传脑炎病毒(TBEV)的现场快速检测的方法。方法针对TBEV NS1基因设计一对特异性螺旋引物,在等温条件下建立逆转录聚合酶螺旋反应(RT-PSR)检测方法,优化反应条件,对特异性和灵敏性进行分析,应用全血模拟标本评价RT-PSR检测的符合率。结果成功建立并优化了TBEV的RT-PSR检测方法,RT-PSR法在61℃的温度下只需一种酶可一步实现逆转录和扩增,55 min可完成TBEV的检测,并可通过SYBR GreenⅠ直接肉眼判读结果,该方法特异性强,灵敏性高,最低检测限为107.341×10^(-6)ng/μL,是PCR的100倍。全血模拟标本符合率为100%,灵敏性比RNA标准品低10倍。结论RT-PSR方法具有良好的特异性和灵敏性,可用于基层对TBEV的现场快速检测。