摘要：根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。

摘要：根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因 ,将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中 ,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,HA1基因获得表达 ,重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达HA1基因的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 8mmol L ,诱导时间为 3h。Westernblot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明 ,抗原的最佳包被浓度为 4 μg mL ,血清的最佳稀释度为 1∶2 0 0 ,阳性标准初步定为 :OD待检血清>0 5 ,且OD待检血清 OD阴性血清 >2。

摘要：根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物 ,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约 16 83bp的血凝素基因 ,将此扩增产物克隆进pMD18_T载体 ,限制性酶切及序列测定后 ,进一步将其亚克隆到pGEX_KG中 ,与GST蛋白融合表达。SDS_PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA基因在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有免疫学活性 ,融合蛋白的分子量约为 90kD ,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点 ,可用于H9亚型禽流感抗体的检测。

摘要：目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5。将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。

摘要：参考已发表的禽流感病毒 (AIV)H7亚型血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,经RT PCR扩增了AIV H7亚型的HA1基因片段 ,再将该片段定向插入到原核表达载体 pGEX 4T 2中 ,转化大肠埃希氏菌。重组表达载体经酶切和测序鉴定后 ,用IPTG诱导表达。用Western blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明 ,融合表达蛋白能与AIVH7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应 ,而与H5N1、H9N 2等其他 13个亚型的抗血清无交叉反应。

摘要：根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a(+)载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。

摘要：参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×***印迹表明表达蛋白具有免疫活性.

摘要：根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。

摘要：根据H9N2亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,从本室分离保存的H9N2亚型猪流感病毒中扩增出血凝素基因,并将其克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定后,进一步将其信号肽缺失并亚克隆到pGEX-KG中,使其在*** BL21(DE3)中与GST融合表达。SDS-PAGE显示表达的融合蛋白的相对分子质量约为90 000。Western印迹表明表达的蛋白质具有免疫学活性。表达产物位于包涵体中,包涵体经变性、复性处理,利用复性产物作为抗原,经碳二亚胺(EDAC)将表达产物和羧基化的乳胶共价偶联,建立了H9亚型猪流感病毒抗体的乳胶凝集试验的检测方法,结果表明,应用HA重组蛋白作为诊断抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于H9亚型猪流感抗体水平监测、流行病学调查和现地疫病普查。

摘要：参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。