摘要：目的尝试构建人血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)基因双顺反子表达载体并检测其在293T细胞中的表达情况和生物学活性,为深入探讨LOX-1在动脉粥样硬化中的作用和以LOX-1为靶点建立干预机制治疗动脉粥样硬化奠定基础。方法首先根据Primer5.0软件设计引物,采用聚合酶链反应法以LOX-1 c DNA片段为模板扩增LOX-1基因完整编码区,克隆至T载体,经测序成功后亚克隆到双顺反子真核表达载体p IRES2-Ac GFP1-Nuc。利用脂质体转染法将双顺反子重组表达质粒转染至293T细胞,倒置荧光显微镜检测质粒转染情况。采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹法鉴定LOX-1基因在核酸和蛋白水平的表达,采用激光共聚焦检测LOX-1基因在293T细胞膜上的表达,激光共聚焦和流式细胞术检测表达在293T细胞膜上的LOX-1结合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学活性。结果成功构建p IRES2-LOX-1双顺反子重组表达载体,将其转染293T细胞后,观察到绿色荧光蛋白基因的表达,初步表明LOX-1基因转染至293T细胞。进一步分子水平鉴定结果表明LOX-1基因在293T细胞核酸和蛋白水平均得到表达,激光共聚焦结果证明LOX-1基因在293T细胞膜上表达。最后激光共聚焦和流式细胞术结果证实表达在293T细胞膜上的人LOX-1基因可以结合氧化型低密度脂蛋白。结论成功构建人LOX-1基因双顺反子表达载体,在此基础上证明其在293T细胞膜上得到表达,并且具有结合ox-LDL的生物学活性,为后续体外研究其在动脉粥样硬化中的作用以及以此为靶点建立干预机制奠定了基础。

摘要：目的设计合成有效的靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体。方法根据siRNA的设计原则,以血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链,再经变性、复性后形成双链血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1shRNA。采用DNA重组技术,将血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,脂质体法转染人脐静脉内皮细胞株,半定量逆转录聚合酶链反应法检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达。结果测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因RNA干扰表达载体;靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA表达载体转染人脐静脉内皮细胞株后,其凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达显著下调。结论成功构建了能有效抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA表达的发卡样血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因RNA干扰表达载体,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供一种研究基础。