摘要：目的:筛选日本血吸虫可能的特异性膜蛋白,并根据筛选结果在日本血吸虫成虫中尝试克隆某一可能具有免疫保护功能的预测蛋白的编码序列,为血吸虫病防治研究寻找新的疫苗候选分子或药物靶标。方法:以"Schistosoma japonicum"和"membrane or tegument"为关键词,在公共数据库NCBI进行查找并下载数据,建立本地化的日本血吸虫膜蛋白序列数据库,与本实验室建立的曼氏血吸虫、人类、大鼠及小鼠蛋白质数据库等进行多序列比对,筛选日本血吸虫特异性膜蛋白,同时通过CBS网站相应分析工具软件预测目的蛋白的特征和功能。针对其中可能有免疫保护功能的预测蛋白的预测编码序列设计引物,采用RT-PCR技术从日本血吸虫成虫中扩增出该编码序列,并克隆入pGEX-4T-1构建原核表达重组质粒。结果:共检索到153个理论推测的日本血吸虫膜蛋白序列,筛选出28个可能的日本血吸虫特异性膜蛋白;成功从日本血吸虫成虫中扩增出相对分子质量为15 000的预测蛋白的预测编码序列,暂命名为sj15基因,同时成功构建pGEX-4T-1-sj15重组质粒。结论:成功筛选出多个日本血吸虫特异性膜蛋白;从日本血吸虫成虫中成功克隆出GenBank公布的预测的sj15基因,证实了成虫中该预测基因的存在,并成功构建原核表达载体,为进一步的功能研究奠定了基础。

摘要：目的制备重组日本血吸虫核糖核酸酶T2蛋白(rSj RNase T2),并分析其生物学功能。方法根据编码RNase T2开放阅读的基因序列设计、合成一对5′端带有酶切位点的引物。采用PCR方法从质粒CP1412/PEU-GST中扩增编码RNase T2蛋白成熟肽的基因片段,亚克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a。将重组表达质粒转化到*** BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍螯合亲和层析胶在变性条件下纯化rSj RNase T2蛋白。纯化蛋白通过尿素浓度梯度透析的方法进行复性,制备可溶性rSj RNase T2。以酵母RNA为底物进行消化,采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测rSj RNase T2酶活性。用纯化的rSj RNase T2免疫小鼠,采用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清特异抗体水平,观察其抗原性;采用检测Western blot抗rSj RNase T2抗体IgG与成虫可溶性虫抗原、成虫外分泌抗原、虫卵可溶性抗原和虫卵外分泌抗原的反应性,并观察Sj RNase T2在虫体中的分布。以rSj RNase T2刺激巨噬细胞RAW264.7,通过流式分析观察RAW264.7细胞表面标志物CD16/32、CD206表达水平的变化,采用RT-PCR检测RAW264.7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶基因mRNA的表达水平,采用ELISA检测RAW264.7细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化,以观察Sj RNase T2的免疫调节功能。结果重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a构建成功,经IPTG诱导,能表达重组Sj RNase T2蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,经过复性能获得部分可溶性蛋白。rSj RNase T2具有酶活性,能够水解酵母RNA。ELISA检测rSj RNase T2免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1︰200 000,该抗血清能识别来源于血吸虫虫卵及虫卵外分泌抗原中的天然RNase T2。rSj RNase T2可诱导巨噬细胞向M2型方向转化,表达高水平的IL-10、精氨酸酶及CD206表面分子。结论 rSj RNase T2表达成功。该蛋白具有天然的酶学特性和抗原性,能调节巨噬细胞向M2型方向分化。

摘要：目的对日本血吸虫氧化还原蛋白(peroxiredoxin of schistosoma japonicum,SjPrx)的表达、纯化,接种小鼠和体外刺激脾细胞,研究SjPrx I在体内外诱导免疫应答的作用及可能机制。方法 Gen Bank获取SjPrx编码序列,设计合成引物进行PCR扩增;构建质粒,通过转化将构建的重组质粒转入感受态细胞,然后小量扩增菌株,电泳检测克隆成功表达。蛋白质印迹法(western blot,WB)验证融合蛋白后大量表达纯化。将重组SjPrxⅠ通过腹腔注射BALB/c小鼠,本科联免疫吸附实验和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测脾细胞分泌细胞因子。结果成功构建了SjPrx I-p ET28a质粒,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达后得到可溶性SjPrx I,纯化后的SjPrxⅠ免疫小鼠,其淋巴细胞高水平表达Th2细胞分泌的IL-4(t=6.69,P<0.001)、IL-10(z=3.18,P=0.001)和IL-13(t=4.21,P=0.001)。结论制备了重组SjPrx I,初步认为其具有Th2型免疫调节功能,但并不能显著抑制体内业已存在的Th1的偏移。

摘要：目的构建日本血吸虫PP2C-1蛋白磷酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析。方法从日本血吸虫基因组数据库中找到一个可能编码PP2C-1蛋白磷酸酶的基因Sj-PP2C-1,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区与pET28a表达载体连接后转化大肠埃希菌并用IPTG诱导表达,对表达产物的磷酸酶活性进行分析。结果成功构建了Sj-PP2C-1蛋白磷酸酶表达载体,其编码区能够在大肠埃希菌中表达分子质量单位为40ku的目的蛋白;采用V2460系统进行检测,Sj-PP2C-1具有PP2C磷酸酶活性。结论 Sj-PP2C-1基因原核表达产物具有蛋白磷酸酶活性,为研究PP2C类蛋白磷酸酶的功能打下了基础。

摘要：　目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。

摘要：目的　识别日本血吸虫大陆株铜锌超氧化物歧化酶 (SjCuZn SOD)基因 ,构建SjCuZn SOD的真核表达载体。方法　将曼氏血吸虫 (Sm )的CuZn SOD全长cDNA序列上网比对 ,寻找Sj相关EST。设计特异性引物从尾蚴cDNA文库扩增相应序列 ,经双酶切、连接、转化 ,克隆入 pcDNA3 .0真核表达质粒 ,并鉴定阳性克隆。　 结果　找到Sj相关EST(登录号BU794891) ,核酸阅读框 (ORF)分析和BLAST比对分析等方法判断为SjCuZn SOD完整的cDNA编码序列 ,含462bp完整阅读框 ,编码 15 4aa。经单双酶切、PCR扩增、核酸测序鉴定 ,验证成功构建了 pcDNA3 .0 SOD真核重组表达载体。　结论　成功构建真核重组表达载体 pcDNA3 .0 SOD ,为在真核表达系统研究SjCuZn

摘要：目的构建日本血吸虫铁蛋白proVAX/GMCSF-SjFerDNA疫苗,观察其诱导小鼠产生抗攻击感染的免疫保护性效果。方法小量制备pGMC/SjFer重组质粒DNA,PCR扩增GMCSF-SjFer基因,将此目的片段亚克隆到真核表达载体proVAX中,构建重组真核表达质粒proVAX/GMCSF-SjFer。雌性昆明鼠随机分为对照组、免疫组和空质粒组。空质粒组小鼠股四头肌注射proVAX,免疫组同法注射重组质粒proVAX/GMCSF-SjFer,对照组注射生理盐水。按0、2、6周设计接种3次。末次接种后第2周,感染血吸虫尾蚴(40±2)条/鼠。感染后第42d剖杀小鼠,灌注法冲虫,计数虫荷和克肝卵数。免疫前和免疫后2周留取小鼠血清,用ELISA法检测抗血吸虫成虫抗体水平。结果经PCR和双酶切鉴定,获得1条约为960bp的目的片段和2条酶切片段。免疫组小鼠的减虫率及减卵率分别为22.46%和29.40%,空质粒对照组分别为3.11%和7.79%,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测免疫组小鼠血清特异性IgG抗体水平增高。结论构建的DNA疫苗proVAX/GMCSF-SjFer能诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫。

摘要：目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。

摘要：目的筛选和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)的Th1型细胞表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法用BLAST比对并预测SjTPI的T细胞表位SjTPI-P18及其对照表位SjTPI-P9。设计并合成其编码DNA,重组入原核表达载体pET-32c(+)后进行表达,获得纯化的重组融合蛋白rSjTPI-P18和rSjTPI-P9。用rSjTPI、rSjTPI-P18及rSjT-PI-P9刺激经照射致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6和C3H/HeJ小鼠淋巴细胞,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果及细胞培养上清中IL-2水平;分别用重组rSjTPI-P18和合成SjTPI-P18刺激rSjTPI-P18、SjTPI-P18或PBS加弗氏佐剂两次免疫的C57BL/6小鼠淋巴细胞,并检测其细胞培养上清中IFN-γ及IL-4水平。结果参照曼氏血吸虫TPI T细胞表位预测的SjTPI-P18及SjTPI-P9,获得了与Trx融合表达的重组肽rSjTPI-P18及rSjTPI-P9。与rSjTPI-P9相比,rSjTPI及rSjTPI-P18均可刺激辐照致弱尾蚴免疫、rSjTPI加强免疫的C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的淋巴细胞增殖且IL-2分泌量增加(P均<0.05);SjTPI-P18及rSjTPI-P18刺激经rSjTPI-P18或SjTPI-P18免疫两次的C57BL/6小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ水平升高(P均<0.05),而IL-4水平较低。结论筛选和鉴定出的SjTPI-P18是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。

摘要：目的观察日本血吸虫感染小鼠调节性T细胞水平动态变化,筛选调节性T细胞功能抑制因子。方法以日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采用流式细胞分析法检测不同感染阶段小鼠体内调节性T细胞水平;通过检测小鼠血清中细胞因子的水平变化,观察免疫反应的极化过程;采用磁珠分离法纯化小鼠脾脏的调节性T细胞,人工设计合成2条寡核苷酸(CpG1-ODN,CpG2-ODN),通过淋巴细胞增殖试验筛选能逆转调节性T细胞功能的刺激因子。结果流式细胞分析发现,随着血吸虫感染进程的发展,小鼠外周血及脾脏调节性T细胞水平逐渐增加,免疫反应逐步向Th2型极化,血清IL-5水平增加,IFN-γ下降。淋巴细胞增殖试验显示,人工合成的寡核苷酸(CpG2-ODN)能有效刺激淋巴细胞增殖,使淋巴细胞的IL-2分泌增加,TGF-γ下降,并能解除调节性T细胞对效应T细胞增殖的免疫抑制作用。结论血吸虫感染可增加小鼠体内调节性T细胞水平,诱导免疫反应向Th2型极化。寡聚核苷酸CpG2-ODN能逆转调节性T细胞的免疫抑制功能。