摘要：为建立快速检测血清4型禽腺病毒病(Fowl aviadenovirus serotype 4,FAdV-4)的基于Taq Man探针的Quantitative real-time PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Hexon基因序列,设计相关的qPCR特异性引物和探针,经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后,最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明,优化后标准曲线决定系数(R^(2))为0.998,扩增效率(E)为95.226%,该方法效果良好。利用该方法,除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到,该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝,而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10000个拷贝,说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%,该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测,结果显示,qPCR方法检出率为51.1%,而普通PCR方法检出率为32.8%;同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%,而基于普通PCR特异性引物检出的符合率为82.35%,表明该qPCR方法针对临床疑似样品的检测准确性更高。该方法的建立有助于推动禽腺病毒病的分子流行病学研究和防控。

摘要：通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。

摘要：目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

摘要：根据多个GenBank登录的血清4型禽腺病毒株hexon基因序列,经多序列比对分析选取高度保守区域设计特异性引物探针,建立了检测FADV⁃4的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法扩增产物长度为71 bp,在101~107 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.995,初始模板最低检测下限为7.3×101 copies/μL质粒DNA,与常规PCR相比灵敏度高约1000倍。以H9亚型流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管病毒、传染性法氏囊病毒、网状内皮增生病毒、白血病病毒、减蛋综合征病毒、传染性贫血病毒核酸为模板时,均检测不到荧光信号,批内和批间重复性试验变异系数均不超过2%,具有良好的特异性和重复性。本文建立的方法可为FADV⁃4的早期感染诊断及定量分析提供有效技术手段。

摘要：为了阐明Ⅰ群禽腺病毒在我国部分地区鸡群的感染状况,对2015年10月~2016年10月采集自山东、河北等鸡场疑似禽腺病毒感染病鸡的肝脏样品,通过病毒分离、PCR、动物回归试验等进行分离鉴定,最终鉴定出11株血清4型禽腺病毒。根据Gen Bank上发表的Ⅰ群禽腺病毒(FAd VⅠ)Hexon基因序列设计引物,对分离的11个毒株测序,并与其他血清型参考毒株进行比较分析。结果表明:分离的11株FAd V同源性高达99.7%以上,与FAd V-4参考毒株的核苷酸序列的同源性在98.3%~99.7%之间,与FAd V-10血清型序列同源性较近,为97.2%,而与FAd V-5、FAd V-8血清型同源性较低,仅在66.4%~87.2%之间。研究结果为FAd V的防控和新疫苗研发提供了可靠的理论依据。

摘要：根据禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的Hexon基因设计1对特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了荧光定量PCR检测方法。结果显示:以重组质粒为标准品建立的标准曲线在7.3×10^3拷贝/μL^7.3×10^8拷贝/μL具有良好的线性关系;该方法仅对FAdV-4扩增呈阳性,对NDV、AIV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b的检测均为阴性;对FAdV-4最小检出的梯度为7.3×10^1拷贝/μL,灵敏度为普通PCR的100倍;批内和批间重复试验的变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测,表明该方法的检出率比普通PCR方法高10%,可用于FAdV-4的快速诊断和定量分析。