摘要：背景:血管内皮生长因子(VEGF)是基因治疗下肢多平面、多节段、小动脉粥样硬化闭塞症的最常用的治疗基因,基因治疗需要高纯度和大剂量的质粒,而目前的质粒纯化方法存在着成本高、操作繁琐、接触有毒试剂等缺点。目的:探索一种新的方法提纯VEGF质粒。设计:对照实验研究。地点和对象:实验由上海第二医科大学附属仁济医院血管外科完成。对象为磁性纳米粒子(华东理工大学超细粉末研究所惠赠)。干预:制备和修饰3种磁性纳米粒子:二乙基氨基乙基直接连接的磁性纳米粒子(DEAE-MNP),三链螺旋结构的磁性纳米粒子(TMNP)和探针直接连接的磁性纳米粒子(PMNP),分别从细菌裂解上清液中提纯VEGF质粒。主要观测指标:紫外分光光度计检测吸光率(A值)及纯度、琼脂糖凝胶电泳、目的基因测序。结果:①3种磁性纳米粒子均能从细菌裂解上清液中提取VEGF质粒,A值分别为:DEAE-MNP,0.1160±0.0071;TMNP,0.01825±0.0038;PMNP,0.01852±0.0012;纯度与层析柱法(金标准)无统计学差异,其中DEAE-MNP的得率最高。②电泳图像中未见杂质及其他核酸。③质粒送交测序,目的基因序列与文献报道相符。结论:该方法为从混合物中提取高纯度的生物活性物质开创了新途径。

摘要：背景:肿瘤复发是残存的肿瘤细胞重新增殖生长为病灶的过程,在此过程中某些基因可能起着重要的调控作用。目的:探讨E-cadherin,CD44H和VEGF基因的表达与鼻咽癌患者复发及康复的关系,探索促进康复的途径。设计:以诊断为依据,标准对照横断面回顾性研究。地点和对象:本研究由汕头市中心医院耳鼻咽喉-头颈外科完成,选择1995年3月～10月的原发性鼻咽癌放疗的62例鼻咽癌患者,年龄17～70岁。方法:免疫组化SP法检测鼻咽癌组织中E-cadherin,CD44H和VEGF的表达强度。以细胞浆内或细胞膜上出现黄色染色为阳性标记,采用半定量方法进行结果判定。主要观察指标:鼻咽癌组织中E-cadherin,CD44H和VEGF的表达强度。结果:在鼻咽癌放疗后复发组中,E-cadherin的表达减弱(阳性表达率为52.4%),CD44H和VEGF的表达增强(阳性表达率分别为85.7%,80.9%),无复发组中三者阳性表达率分别为85.4%,65.9%,73.2%,两组的表达差异均有显著性意义(P<0.05,P<0.01,P<0.01),CD44H与VEGF在鼻咽癌放疗后复发组中的表达有正相关关系(r=0.535,P<0.05)。结论:E-cadherin,CD44H和VEGF的表达均与鼻咽癌放疗后复发的关系密切,CD44H和VEGF存在协同作用,他们可作为评估复发风险的生物学标志,可预测鼻咽癌患者放疗后康复的效果。

摘要：目的利用RNA干扰(RNAi)技术,构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)双基因的短发夹RNA(short hairpin,shRNA)真核表达载体用于胶质瘤基因治疗。方法分别设计并体外合成靶向基因VEGF、NGF的特异性编码shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BglⅡ-HindⅢ酶切线性化的pSUPER质粒H1启动子下游,构建shRNA重组质粒,进而脂质体介导瞬时转染胶质瘤细胞系U251,半定量RT-PCR检测VEGF mRNA、NGF mRNA表达。结果重组质粒经过酶切鉴定和测序,插入片段的序列大小、位点和方向均与已合成的寡核苷酸的序列完全一致,在瞬时转染胶质瘤细胞后下调了VEGF mRNA、NGF mRNA的表达。结论成功构建靶向基因VEGF、NGF的shRNA真核表达载体,为进一步应用RNAi技术,研究其对胶质瘤的抑制作用奠定基础。

摘要：背景糖尿病视网膜病变（DR）是一种严重的糖尿病并发症，其确切的发病机制尚不清楚，有研究认为细胞因子增加单核细胞和内皮细胞黏附的过程，进而引起视网膜毛细血管炎症反应是DR发生发展的关键因素。目的检测2型DR患者血清中血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF—α）的质量浓度，并探讨其临床意义。方法采用前瞻性病例对照研究设计。对90例2型糖尿病患者血清中VEGF、IL-2和TNF-α的质量浓度采用双抗体夹心ELISA法进行检测。根据散瞳后眼底检查和荧光素眼底血管造影（FFA）检查，将实验组分为无DR组30例、单纯性DR组30例、增生型糖尿病视网膜病变（PDR）组30例，对照组为健康体检者30名。结果无DR组、单纯性DR组、PDR组血清中VEGF的质量浓度为（217．35±27．87）、（298．31±49．26）、（341．23±40．18）ng／L，IL-2的质量浓度为（12．12±1．57）、（16．43±2．26）、（21．36±0．86）ng／L，TNF-α的质量浓度为（11．63±0．94）、（17．52±0．65）、（22．01±0．87）ng／L，与对照组VEGF、IL-2和TNF—α的质量浓度（193．46±37．39）、（8．99±0．57）、（7．31±0．52）ng／L比较，4个组间差异均有统计学意义（F=126．380，P〈0．01；F=120．370，P〈0．01；F=99．840，P〈0．01）。对照组、无DR组、单纯性DR组与PDR组血清VEGF、IL-2、TNF—α的质量浓度有依次增加的趋势。各组患者血清中的VEGF、IL-2、TNF—α质量浓度间存在正相关关系（r=0．749，P〈0．01；r=0．631，P〈0．01）。无DR组、单纯性DR组、PDR组间病程比较差异有统计学意义，且有明显增加的趋势（F=137．230，P〈0．01）；各DR组血清中VEGF、IL-2、TNF-α质量浓度组与病程均呈正相关（r=0．791，P〈0．01；r=0．665，P〈0．01；r=0．632，P〈0．01）。结论VEGF、IL-2及TNF-α存DR的发病和进展过程中起重要作用。

摘要：目的采用正交实验设计法,探究低频超声联合微泡抑制小鼠前列腺癌细胞(RM-1)血管内皮生长因子(VEGF)表达的最优参数组合。方法选定超声功率、超声频率、辐照时间、微泡/细胞悬液体积比为正交优化的4个因素,每个因素设定4个水平,分别为超声频率:20 k Hz、80 k Hz、500 k Hz及800 k Hz;超声功率:100 m W/cm2、180 m W/cm2、270 m W/cm2及360 m W/cm2;辐照时间:30 s、60 s、90 s及120 s;微泡/细胞悬液体积比:10%、20%、30%、40%,按照四因素四水平设计正交实验表,得到16个实验组,各组按相应条件采用连续波辐照后细胞继续培养24 h,定量RT-PCR检测各组VEGF m RNA表达量从而获取最优组合条件。将小鼠RM-1细胞均分4组:对照组不进行任何处理;单独超声组采用正交实验设计法所得最优组合条件辐照细胞,但不加入微泡;单独微泡组仅加入最优百分体积的微泡;低频超声联合微泡组采用正交实验设计法所得最优组合条件辐照并加入最优百分体积微泡。各组处理后,即刻台盼蓝染色观察细胞的损伤情况;培养24 h后,采用Western blot印迹法检测小鼠RM-1细胞中VEGF表达量。结果抑制小鼠RM-1细胞VEGF m RNA表达的影响因素由大到小依次为:超声频率、超声功率、微泡/细胞悬液体积比、辐照时间;各因素不同水平的影响程度由大到小依次为:1超声频率:800 k Hz、500 k Hz、80 k Hz、20 k Hz;2超声功率:360 m W/cm2、180 m W/cm2、270 m W/cm2、100 m W/cm2;3辐照时间:30 s、90 s、120 s、60 s;4微泡/细胞悬液体积比:20%、10%、40%、30%。正交实验设计法所得最优组合条件为:超声频率800 k Hz、超声功率360 m W/cm2、超声辐照时间30 s及微泡/细胞悬液体积比20%。低频超声联合微泡组损伤细胞多于其他各组,单独超声组可见少量损伤细胞,对照组和单独微泡组损伤细胞极少。低频超声联合微泡组VEGF表达量少于其他各组,单独超声组表达量也少于对照组和单独微泡组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论低频超声联合微泡造影剂抑制小鼠RM-1细胞VEGF m RNA表达的最优组合条件为:超声频率800 k Hz,超声功率360 m W/cm2,超声辐照时间30 s,微泡/细胞悬液体积比20%。在此实验条件下可以显著抑制VEGF的最终表达量。

摘要：目的:靶向干预血管内皮生长因子(VEGF)mRNA前体(pre-mRNA)第8外显子选择性剪接,重建抗血管生成因子的优势表达,高效抑制肾细胞癌血管生成。方法:针对VEGF pre-mRNA的剪接特点,分别在第7内含子和8a外显子交接附近、交接点和下游设计了与之特异性结合的3条小干扰RNA(siRNA),探讨靶向不同区域的siRNA对VEGF pre-mRNA选择性剪接的影响,并进一步观察其调控肾癌细胞增殖、迁移、克隆形成及血管生成等功能的作用。结果:促血管生成的VEGF剪接体(VEGF165a)在肾细胞癌中表达明显上调,而抗血管生成的VEGF165b在肾细胞癌中表达明显下调;针对剪接位点设计的靶向siRNA能够有效干预VEGF选择性剪接,使VEGF165a表达下降,VEGF165b表达显著上升;与此同时,肾癌细胞增殖、迁移、促血管生成能力显著下降。结论:本研究为进一步利用siRNA调控基因选择性剪接奠定理论基础,并为肾细胞癌的靶向治疗提供了更具针对性的新策略。

摘要：目的:以血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA为靶点,设计、构建VEGF的RNA干扰慢病毒载体,并对其在大鼠附睾的沉默效果进行验证。方法:构建3种附睾VEGF-shRNA慢病毒表达载体VEGF-shRNA-1、VEGF-shRNA-2、VEGF-shRNA-3,提取3种阳性克隆质粒测序,转染HEK293-T细胞后产生慢病毒质粒。大鼠随机分为空白对照组、NC-shRNA阴性感染组、VEGF-shRNA-1感染组、VEGF-shRNA-2感染组、VEGF-shRNA-3感染组,将病毒液分别注射到各组大鼠双侧附睾;实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹检测各组大鼠附睾VEGF的mRNA及蛋白沉默效果。结果:测序结果证明3种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,VEGF感染组mRNA及蛋白表达量均较阴性感染组和空白对照组明显降低,其中以VEGF-shRNA-3感染组干扰效果更为有效。结论:成功设计了VEGF基因的RNA干扰靶点和制备了VEGF基因的慢病毒载体,VEGF-shRNA-3能有效抑制附睾VEGF的表达。

摘要：目的构建人血管内皮生长因子(VEGF)m RNA靶向小片段干扰RNA(si RNA)表达的慢病毒载体,并测定其对VEGFA基因的沉默率,选择效率最高的干扰序列。方法设计3种人VEGFA靶向的发夹样si RNA(KD 1、KD 2、KD 3),分别2条互补的寡核苷酸链,退火后连接入p GCSIL-GFP载体,转化扩增后得到重组载体p GCSIL-GFP-si VEGFA,进行测序。将重组载体与慢病毒包装辅助质粒p Helper 1.0和p Helper 2.0通过Lipofectamine 2000共同转染至细胞人胚肾细胞株(293 T),产生病毒后,再转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),逆转录-聚合酶链反应法检测转染细胞VEGFA m RNA的表达水平,比较3种si RNA序列的效率。结果经过酶切鉴定与测序,p GCSIL-GFP-si VEGFA构建成功。转染至HVUEC后,细胞VEGFA m RNA表达水平均明显降低(KD 1:0.614±0.043;KD 2:0.334±0.030;KD 3:0.201±0.015),其中以KD 3为相对最有效的si RNA序列。结论成功构建了针对VEGFA m RNA的si RNA载体,并可以显著抑制内皮细胞VEGFA m RNA的表达。

摘要：目的构建人血管内皮生长因子受体(VEGFR)-3胞外1-3区基因原核表达体系。方法提取人胎盘组织上总RNA,经反转录制备cDNA;从Genebank获取该基因序列,设计引物进行聚合酶链反应(PCR)以扩增VEGFR-3胞外1-3区基因片段,回收和纯化PCR产物并将其插入pMD18T载体中进行克隆;测序正确后,将目的基因克隆入原核表达载体pBV220,对获得的原核表达质粒进行初步鉴定。结果构建了pBV220-VEGFR-3质粒表达载体,经DNA测序鉴定序列正确。结论应用基因工程技术,成功构建了VEGFR-3原核表达载体。

摘要：目的:构建可涂布于介入器械的人血管内皮生长因子(VEGF)真核表达载体。方法:根据人VEGFA(NM_001025366)目的序列设计引物制备目的基因及载体,双酶切载体p IRES2-ZsGreen1和目的基因homo VEGFA进行连接后转化入大肠杆菌,构建质粒p IRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA并测序鉴定。结果:目的基因VEGFA已连接到载体pIRES2-ZsGreen1,大小约1400 bp,与人VEGFA(NM_001025366)目的序列比对结果一致,未见变异。质粒p IRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA构建成功。结论:成功构建重组人血管内皮生长因子真核表达载体,可用于涂布介入器械表面进行下一步实验。