摘要：目的探讨mi RNA-203转染诱导人表皮干细胞向汗腺细胞分化的可能性及机制。方法取包皮环切术获得的人正常包皮组织5例,采用0.25%胰蛋白酶-EDTA联合消化法分离表皮和真皮,应用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化人表皮干细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,行β1整合素(integrinβ1,ITGB1)、角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)、CK1、CK10、CK18、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)免疫细胞化学染色鉴定。通过脂质体转染将mi RNA-203模拟物导入人表皮干细胞(实验组),转染对照mi RNA模拟物作为对照组。免疫细胞化学染色法对转染后细胞行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA单克隆抗体检测鉴定;实时荧光定量RT-PCR检测转染前及转染后72 h的细胞中mi RNA-203、P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA m RNA相对表达量;Western blot法检测P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相对表达量;并对mi RNA-203的m RNA表达与P63的m RNA和蛋白表达分别行Pearson相关分析。结果转染前人表皮干细胞CK19、ITGB1阳性表达,转染后CK1、CK10、CK18、CEA阳性表达。实验组转染后细胞mi RNA-203 m RNA相对表达量显著高于转染前(P0.05)。转染前后mi RNA-203的m RNA表达量与P63的m RNA和蛋白相对表达量均成负相关,转染前相关系数分别为—0.91(t=3.862,P=0.042)及—0.96(t=5.971,P=0.009);转染后相关系数分别为—0.92(t=4.283,P=0.031)及—0.95(t=5.842,P=0.011)。结论 mi RNA-203能诱导人表皮干细胞分化为汗腺细胞,其作用可能是通过靶向抑制P63来实现的。

摘要：目的体外条件下模拟缺氧环境，探讨P311和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）相互作用及对小鼠表皮干细胞（ESC）迁移影响。方法取15只C57BL/6J野生型新生小鼠，5只同属来源P311基因敲除新生小鼠，分离培养2种小鼠ESC，取第1代细胞行形态学观察，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验。（1）取2种小鼠ESC划痕处理后，立即按随机数字表法（下同）将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组（将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养，常氧处理下同）和缺氧组（将细胞置于含体积分数1%氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养，缺氧处理下同），每组12个插件；将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜（DMSO）对照组（用2 μL DMSO溶剂常氧处理1 h后行缺氧培养）、HIF-1α抑制剂组（加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2 μL常氧培养1 h后行缺氧培养）、HIF-1α稳定剂组（加入2 μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1 h后行缺氧培养），每组12个插件。每组各时相点取3个插件分别于划痕后0（即刻）、12 、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度。（2）取野生型小鼠ESC行缺氧培养，蛋白质印迹法检测缺氧0（即刻）、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达。（3）取野生型小鼠ESC同实验（1）分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理，分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达，免疫细胞化学染色法观测P311表达（样本数均为12）。（4）取第2代人胚胎肾293（HEK-293）细胞分为空载缺氧组（转染空载质粒后进行缺氧培养）、P311常氧组（转染P311报告基因质粒后进行常氧培养）、P311缺氧组（转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养）、P311缺氧＋HIF-1α抑制剂组（HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养），分别于培养0、12 h检测荧光素酶活性，采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bonferroni校正。结果（1）ESC结果。细胞呈现铺路石样改变，细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态。CD71－CD49f＋细胞占85%左右，说明ESC的干性较强、纯度较高。与P311基因敲除小鼠常氧组比较，单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05），缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05）。与野生型小鼠常氧组比较，缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小（P〈0.05）。与单纯缺氧组比较，缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大（P值均小于0.05），HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较大（P〈0.05），HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小（P值均小于0.05）。7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显（F＝19.02，P〉0.05）。野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03。与缺氧0 h比较，HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加（P〈0.01），缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h（P〈0.05），缺氧48 h后降至常氧水平（P〉0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降（P值均小于0.05），HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311 mRNA表达量均明显升高（P值均小于0.05）。与单纯缺氧组比较，HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降（P值均小于0.05），而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。与HIF-1α抑制剂组比较，DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高（P值均小于0.05）。（2）HEK-293细胞结果。培养0 h，空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧＋

摘要：目的　设计和构建整合素 β1(integrinβ1)特异性的小干扰RNA表达载体 ,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法　设计靶点特异性的寡核苷酸 ,连接到经BamHⅠ HindⅢ酶切线性化的pSlincer3 .1 H1质粒上。转染重组质粒到表皮干细胞 ,通过免疫印迹 (Westernblotting)实验检测靶基因的抑制情况。结果　构建的小RNA干扰质粒siIntegrinβ1转染表皮干细胞能够抑制靶基因整合素 β1的表达。 结论　成功构建了针对整合素 β1的siRNA质粒 ,为进一步研究整合素在表皮干细胞增殖与分化调控中的作用奠定了基础。

摘要：背景:烧伤创面外用药物五黄油具有抑菌、促进创面愈合的作用,但长期临床应用发现该制剂在止痛、抑制瘢痕形成等方面疗效不确切,且促进表皮生长作用仍有待加强。目的:观察加入黄芪、粉防己碱的改良五黄油不同药物浓度和药物作用时间对人表皮干细胞体外生长增殖的影响。设计、时间及地点:对比观察实验,于2005-10/2006-10在南昌大学医学院烧伤研究所细胞培养实验室完成。材料:2～12岁患者包皮环切术后的新鲜包皮(患者对实验内容均知情同意,并自愿捐献),改良五黄油工作液及五黄油工作液由南昌大学第一附属医院药剂科提供。方法:将不同质量浓度的改良五黄油(0,0.15,0.20,0.25,0.30g/mL)分别加入体外培养的表皮干细胞中,并于5个不同时相点(2,4,6,8,10d),以五黄油为对照组进行MTT细胞生长增殖检测,观察对细胞增殖影响程度。主要观察指标:利用MTT法在酶标仪上分别测定各组表皮干细胞的增殖率。结果:以0,0.15,0.20,0.25,0.30g/mL质量浓度药物作用人表皮干细胞,其增殖程度与改良五黄油的质量浓度正相关性;改良五黄油在0.25g/mL和0.30g/mL质量浓度,相同作用时间(4,6,8d)对表皮干细胞的增殖率高于五黄油,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:在一定的体外作用时间范围内,改良五黄油对表皮干细胞的促增殖能力与药物质量浓度呈正相关;改良五黄油对体外表皮干细胞的增殖效果好于五黄油。

摘要：背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03／2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P〈0．01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。

摘要：背景：目前研究认为表皮干细胞数量及增殖分化潜能的差异，可能是创面愈合能力随年龄增大而逐渐降低的重要原因之一。目的：探讨不同发育阶段人皮肤表皮干细胞B1整合素、角蛋白19、p63转录因子和端粒酶反转录酶的表达特征。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2005—09／2007—04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料：流产胎儿皮肤标本由南昌大学第一附属医院产科提供，4～12周岁少儿、25～45岁成人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本由南昌大学第～附属医院烧伤科提供。方法：标本取材后立即用中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4℃保存。所有标本经系列切片后，分别采用鼠抗人角蛋白19、β1整合素、p63转录因子、端粒酶反转录酶单克隆抗体作为一抗，以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物的表达。主要观察指标：200倍光镜下观察免疫组化染色结果，测定表皮干细胞标志物阳性表达率。结果：胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞B1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶均呈棕黄色阳性表达。胎儿表皮基底层细胞β1整合素、角蛋白19和p63均呈强阳性表达：少儿表皮基底层细胞叶1大部分表达β1整合素、角蛋白19和p63，阳性细胞均匀分布；成人表皮基底层细胞B1整合素、角蛋白19和p63呈弱阳性表达，阳性细胞散在分布；胎儿表皮基底层端粒酶反转录酶阳性细胞表达强度，少儿表皮〉成人表皮。随年龄的增加，β1整合素、角蛋白19、p63和端粒酶反转录酶在胎儿、少儿、成人皮肤组织中的阳性表达率呈下降趋势（F=5．06，P〈0．01）。结论：胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层，端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致。提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关。

摘要：背景:表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义,但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。目的:拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在解放军军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室完成。材料:实验所用皮肤来源于20～30岁女性乳房缩小整形术患者,由北京协和医院整形外科提供。方法:无菌条件下切取皮肤,剪除皮下脂肪组织,采用胶原酶/Dispase酶和胰蛋白酶两步法体外分离培养表皮干细胞。待细胞生长达70%～80%融合时,加入胰蛋白酶消化尚未脱壁的细胞,30s～1min后吸出脱壁细胞,同法传代培养至第5代细胞。主要观察指标:第1,5代表皮干细胞表面标志CD29、CD49f、CD71的表达。流式细胞仪检测第5代细胞生长周期。免疫荧光检测第5代表皮干细胞和传代时胰蛋白酶消化30s～1min即脱壁细胞角蛋白19及波形蛋白的表达。透射电镜观察表皮干细胞超微结构。结果:第1代表皮干细胞CD29阳性率94.32%,CD49f阳性率86.24%,CD71呈弱阳性,经过4次胰蛋白酶差速脱壁去除混杂细胞后,第5代表皮干细胞CD29阳性率96.77%,CD49f阳性率96.31,CD71呈弱阳性,82.58%表皮干细胞处于G0～G1期。第5代表皮干细胞角蛋白19呈阳性,波形蛋白呈阴性,而传代时胰蛋白酶消化脱壁的细胞角蛋白19呈阴性,波形蛋白呈阳性,证实为成纤维细胞。表皮干细胞呈克隆样生长,透射电镜下胞质中可见呈束状排列的角蛋白丝。结论:应用胰蛋白酶差速脱壁法能够简单、有效地获取纯化的表皮干细胞。

摘要：背景:利用干细胞技术修复创面是当前医学领域治疗伤口愈合的重要策略,黄芪具有扶正固本、益气活血、延缓衰老等作用,被广泛应用于临床各科多种病证的治疗。目的:探讨黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的调控作用。设计、时间及地点:细胞分子生物学实验,于2005-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成。材料:烧伤整形患者植皮剩余皮片来源于南昌大学第一附属医院烧伤中心。黄芪注射液为正大青春宝药业有限公司产品,批号0207114,每毫升含黄芪甲苷≥1.0mg,相当于含生药2g。方法:采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原快速贴附法纯化培养人表皮干细胞。实验组以含黄芪、表皮生长因子和角质细胞无血清培养基组成的表皮干细胞培养液进行体外培养,对照组不含黄芪,其余培养条件相同。主要观察指标:计算细胞克隆形成率,流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学染色法和图像定量分析法观察端粒酶反转录酶表达的变化。结果:表皮干细胞呈贴壁生长,10d左右有大的细胞克隆形成,实验组人表皮干细胞克隆形成率、G0/G1期细胞比例均明显高于对照组(t=3.17,P<0.01;t=2.83,P<0.05)。两组细胞端粒酶反转录酶均呈阳性表达,定量分析结果显示实验组平均吸光度值和阳性面积值均明显高于对照组(t=2.25,P<0.05;t=4.12,P<0.01)。结论:黄芪可有效增强人皮肤表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达和体外增殖活性。

摘要：背景：采用多种人工合成材料构建的组织工程皮肤，存在着创面愈合后不耐受摩擦、瘢痕增生及挛缩严重、缺乏皮肤附件等不足。而表皮干细胞尽管在体内可无限增殖分化以维持皮肤更新，但在体外普通培养条件下易发生终末分化。目的：为获得稳定生长的鼠表皮干细胞，拟建立或完善能够调控其增殖分化的体外培养体系。设计、时间及地点：细胞观察，于2007—05／11在广州市创伤外科研究所完成。材料：清洁级1～3d龄Wistar大鼠20只用于制备表皮干细胞。方法：采用两步酶消化法获得单个表皮细胞悬液，Ⅳ型胶原快速贴壁法分选贴壁细胞，加入含胎牛血清、0．05mmol／LCaCl2及表皮细胞生长因子、腺苷、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素等复合的DMEM培养基进行培养，原代分离细胞时胎牛血清体积分数为0．2以维持细胞活性，第2次换液时改为0．1。主要观察指标：光镜下观察细胞生长情况，免疫组化法检测目的细胞角蛋白19和P63整合素的表达，流式细胞仪检测01整合素和CD71的表达，通过细胞周期及生长曲线观察其增殖能力。结果：①Ⅳ型胶原筛选的细胞在复合DMEM培养基中生长良好，细胞活性〉98％，培养6d后形成含100～200个细胞的大克隆，呈鹅卵石样铺满瓶底。②角蛋白19和P63均呈阳性表达，β1整合素表达率为98.57％，CD71表达率为9．05％。③94．99％细胞处于GdG，期，细胞呈指数增长。结论：两步酶消化＋Ⅳ型胶原快速黏附法可成功分选稳定生长的鼠表皮干细胞。含霍乱毒素、腺苷、胰岛素等因子的复合DMEM培养基可维持表皮干细胞的增殖能力，其中合适的血清浓度及Ca^2＋浓度至关重要。

摘要：背景: 表皮干细胞在创伤修复中具有重要作用,从诱导干细胞角度来阐释中药加速受损皮肤再生的机制值得研究。目的: 观察玉红膏对大鼠创伤愈合过程中皮肤组织中表皮干细胞增殖、分化的影响。设计: 随机对照动物实验。单位: 中国中医科学院望京医院药理室。材料: 实验于 2006- 07/09 在中国中医科学院望京医院药理室完成。选用114 只清洁级健康 Wistar 雄性成年大鼠,体质量 180～210 g,由中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。玉红膏购自中国中医科学院广安门医院制剂中心( 批号 20020110) , 京万红为天津达仁堂达二药业有限公司产品( 批号 Z12020440) 。方法: 按完全随机法将大鼠分为玉红膏组、京万红组、模型组,每组 36 只,另设 6 只为正常组。正常组常规饲养不作任何处理,其余各组玉红膏组造模后立即外敷玉红膏,每个创面 0.1 g; 京万红组每个创面外敷京万红0.1 g,每日定时换药 2 次至创面愈合; 模型组创面不予处理。主要观察指标: 于造模后第 1, 3, 5, 7, 14, 21 天 6 个时间点观察记录各组大鼠创面愈合时间并取创面皮缘比较各组各观测点整合素β1 吸光度值及转录因子 p63 阳性细胞数。结果: 纳入大鼠 108 只均进入结果分析。①创面愈合时间: 玉红膏组与京万红组大鼠均短于模型组,差异有统计学意义(P < 0.05) 。②整合素β1 吸光度值及转录因子 p63 表皮层阳性细胞数: 玉红膏组、京万红组及模型组在造模后两指标均高于正常组,差异有统计学意义(P < 0.05); 玉红膏组及京万红组在第 7 天达到峰值,峰值出现的时间早于模型组,峰值的强度高于模型组,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论: 玉红膏有促进大鼠创面愈合的作用,该作用可能与其诱导创缘残留的表皮干细胞增殖分化有关。