摘要：目的探讨促红细胞生成素对过氧化氢氧化损伤人视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制。方法采用600μmol.L-1的过氧化氢造成体外培养的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤模型。实验设计分为5组:对照组,过氧化氢模型组,过氧化氢+10 kIU.L-1EPO组,过氧化氢+20 kIU.L-1EPO组和过氧化氢+40 kIU.L-1EPO组。MTT法检测细胞活性,测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞法测定细胞的凋亡率。结果过氧化氢模型组RPE细胞的活性明显降低,不同浓度的EPO药物干预组的细胞活性较模型组明显升高,并随着EPO浓度的升高而升高。过氧化氢模型组RPE细胞SOD活性降低,MDA的含量增加;而EPO药物干预组SOD活性较模型组明显升高,MDA含量减少,差异有显著性。过氧化氢模型组RPE细胞的凋亡率升高,而不同浓度的EPO药物干预组降低RPE的凋亡率,凋亡率随着EPO浓度的升高而降低。结论促红细胞生成素对过氧化氢诱导的人RPE细胞的氧化损伤有保护作用,其机制可能与抑制氧化反应、提高抗氧化酶活性、减少细胞凋亡有关。

摘要：目的:探讨RNA干扰抑制整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞增殖和迁移的影响。方法:体外培养hRPE细胞,设计并合成特异性人ILK的RNA干扰片段,阳离子脂质体转染入人视网膜色素上皮细胞,利用RT-PCR及Western blot半定量检测siRNA对ILK基因及蛋白表达的抑制作用,MTT方法检测转染前后siRNA对细胞增殖的抑制作用。损伤愈合实验和Transwell实验观察人视网膜色素上皮细胞迁移能力的改变。结果:培养的hRPE细胞存在ILK的基因转录表达,siRNA显著抑制hRPE细胞ILK的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。MTT、损伤愈合实验和Transwell实验提示转染ILK-siRNA后人视网膜色素上皮细胞的增殖、迁移能力有明显下降,与正常对照组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:特异性ILK-siRNA能有效抑制ILK在hRPE的mRNA和蛋白的表达并显著降低hRPE的增殖和迁移能力。

摘要：目的研究整合素连接激酶(integrin linked kinase,ILK)小分子干扰RNA(siRNA)对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞增殖的影响。方法培养hRPE细胞,角蛋白鉴定。以ILK为靶基因设计合成特异性的siRNA干扰片段转染hRPE细胞。荧光显微镜下观察转染效率,选择转染效率最高的干扰片段进行细胞转染。RT-PCR检测siRNA对ILK基因表达的抑制作用,MTT法检测转染前后hRPE细胞增殖活性。结果 ILK-siRNA可以成功转染至hRPE细胞,转染24h后hRPE细胞中ILK mRNA的相对表达水平在正常对照组、单纯脂质体组、阴性对照组及转染组中分别为0.44±0.48、0.43±0.38、0.42±0.47、0.32±0.71,正常对照组、单纯脂质体组和阴性对照组中ILKmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),转染组ILKmRNA的表达较正常对照组明显降低,差异有显著统计学意义(F=21.78,P<0.01)。不同浓度ILK-siRNA转染组在不同时间点细胞增殖较正常培养组明显降低(P<0.01),50nmol·L-1浓度转染组对hRPE细胞的生长抑制最明显。结论 hRPE细胞表达ILK,siRNA抑制ILKmRNA的表达,在一定范围呈时间浓度依赖性抑制hRPE细胞增殖。

摘要：目的探讨增生细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen,PCNA)核酶(ri-bozyme,Rz)对PCNA表达及细胞增生的影响,为进一步基因治疗增生性玻璃体视网膜病变提供实验基础。方法设计构建针对PCNA的锤头状核酶(PCNα-Rz),通过阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的视网膜色素上皮细胞(经此处理的为Rz载体组),观察其在细胞中的分布,应用3H-TDR掺入实验及四甲基偶氮唑盐比色实验检测细胞增生及活性,应用免疫组织化学技术检测细胞内PCNA表达水平,并设立裸Rz组、空载体组和对照组进行对照研究。结果在脂质体介导下PCNα-Rz可成功转染培养的视网膜色素上皮细胞,较裸PCNα-Rz转染效率明显增高;Rz载体组细胞增生活性显著低于裸Rz组、空载体组及对照组,细胞生长抑制率显著提高(81.2%);Rz载体组细胞PCNA表达水平(9.2±1.3)%显著低于裸Rz组(27.5±4.3)%、空载体组(37.4±5.2)%和对照组(43.6±5.8)%,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论PCNα-Rz能显著抑制培养的兔视网膜色素上皮细胞中PCNA的表达,降低细胞的增生活性,此项技术有望应用于人眼并可能成为防治增生性玻璃体视网膜病变的有效手段。

摘要：目的研究RNA干扰抑制整合素连接激酶(ILK)对人视网膜色素上皮(hRPE)细胞迁移的影响。方法体外培养hRPE细胞,设计并合成特异性人ILK的RNA干扰片段,脂质体转染入hRPE细胞,RT-PCR半定量检测siRNA对ILK基因表达的抑制,损伤愈合实验和Transwell实验观察hRPE细胞的迁移能力的变化。结果培养的hRPE细胞存在ILK的基因表达,siRNA显著抑制hRPE细胞ILK的表达,Transwell实验和损伤愈合实验提示转染ILK-siRNA后hRPE细胞的迁移能力较正常对照组下降(P<0.01)。结论特异性ILK-siRNA干扰片段能有效抑制ILK在hRPE细胞中的表达并显著降低其细胞的迁移能力。

摘要：目的观察体外化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原代培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,cx43)基因和蛋白表达的影响。方法设计合成针对人cx43基因的小干扰片段(siR-NA1、siRNA2、siRNA3)和1条阴性对照siRNA0,在脂质体的介导下转染培养的人RPE细胞,采用RT-PCR确定最有效的抑制片段;针对siRNA的有效片段,分为不同浓度(50～30nmol.L-1)转染培养细胞,培养72h后进行MTT增生试验,观察其对人RPE细胞增生能力的影响,确定最有效的浓度;siRNA转染细胞后,分别培养12h、24h、48h、72h后进行Westonblot试验,观察不同时间点其对cx43蛋白表达的影响。结果体外合成的3条siRNA均在一定程度上抑制cx43基因的合成,其中siRNA1是最有效的抑制片段,根据条带灰度比其抑制率达到72%;siRNA1可以显著促进人RPE细胞的增生,增生率达到146%;明显抑制其cx43蛋白的表达(P<0.01),抑制率达到61%;从浓度组间结果可以看出,siRNA的最佳作用浓度是250nmol.L-1,在此浓度之前效率与浓度呈正比,超过此浓度后各浓度组间差异无统计学意义;比较不同时间点,siRNA转染人RPE细胞24h后开始抑制cx43表达,48h后对cx43蛋白合成抑制率最明显。结论化学合成的siRNA可以有效抑制培养的人RPE细胞cx43基因的表达,促进细胞的增生,这种基因沉默作用可能对于视网膜色素上皮组织的再生有一定作用。

摘要：增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是一种严重的致盲性眼病，因此，研究药物对PVR的防治作用具有重要的临床意义。本研究拟用钙调素（calmodulin, CaM)抑制剂——三氟啦嗪( trifluoperazine ,TFP) 作用于体外培养的豚鼠视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE)细胞，应用IP3［3H］检测系统测定 RPE细胞内IP3浓度的动态变化，同时，应用Fura-2/AM荧光负荷技术测定RPE细胞内游离Ca2+（［ Ca2+］）i水平的变化,探讨在 TFP抑制RPE细胞增生过程中，IP3与［ Ca2+］i浓度的关系。1 材料和方法 材料：(IP3)［3H］检测试剂盒购自Amersham公司，液体闪烁计数仪LS-6500 Beckman产品，超高速离心机LE-89 Beckman 产品， F-2000荧光分光光度计日立公司产品，Fura-2/AM荧光指示剂Sigma产品。豚鼠RPE细胞培养及鉴定同文献［1］。药物作用曲线及细胞活力测定同文献［2］。 RPE细胞3H-TdR掺入法：取生长状态良好的RPE细胞，以5×106细胞/ml密度接种于96孔培养板，常规培养 24 h。空白对照加入不含任何药物培养液，实验组按实验设计需要的含药培养液，各浓度及对照均设 3孔，培养 72 h后，以每孔37 kBq的3H-TdR标记RPE细胞 6 h，收集细胞于玻璃纤维膜上，烘干，加入闪烁液，液闪计数仪测定3H-TdR掺入每分钟计数值（counts per minute , CPM）。以上实验同样条件重复2次，并以cpm值计算DNA合成抑制率，即（对照组cpm－实验组cpm）/对照组cpm。 IP3活性检测方法：各组RPE细胞（5×106个细胞），以平衡盐液冲洗 2次，以 1 mmol/L 二氯化锂抑制IP3水解，37℃培养箱孵育30 min,液氮终止反应，－70℃保存。将各个样品于 0℃下研磨成粉末，再加入15%三氯乙酸2 ml, 4℃ 2 000 r/min离心15 min，取上清 1 ml加入水合饱和乙醚充分混合，再4℃ 2 000 r/min离心15 min，反复3次，下层水相用2 mol/L NaHCO3调pH值为7．5，－20℃保存，待测IP3,按说明书制成曲线，测IP3浓度。 细胞内［Ca2+］i测定：处于融合状态的豚鼠RPE细胞，在无血清的改良依格培养液中孵育24 h，制成细胞悬液，细胞活性在95％以上，以终浓度为 5 μmol/ml Fura-2/AM负载40 min［3］，用分光光度计检测，发射波长为510 nm，激发波长为340 nm和380 nm，最大荧光由0．1％Triton测得，最小荧光由10 mmol/L的EGTA测得，每次测量前输入在上述两激发波下测得的自发荧光值及解离常数（224 nmol/L）, 微机自动算出［Ca2+］i值。

摘要：目的观察牵拉力诱导下RPE细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达及两者之间的关系。设计实验研究。研究对象ARPE-19细胞株。方法应用Flexcell-5000应力加载系统牵拉3D-RPE模型。根据不同大小牵拉力分为对照组(无牵拉力组)、A组(20%形变组)、B组(10%形变组)、C组(5%形变组)。各组依照不同的时间点收取样本进行检测。应用实时荧光定量PCR检测各组不同时间点(0、24、48 h)VEGFA mRNA的表达情况,蛋白印迹法检测(0、24、48 h)VEGFA-165的表达以及ELISA方法检测(0、12、24、36、48 h)细胞上清液中VEGFA的分泌。同时,为了体外定量检测细胞VEGF的促新生血管形成能力,使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行了体外成管实验(24、48h)。主要指标VEGFA mRNA相对表达量、VEGFA-165相对表达量、细胞上清液VEGFA分泌量、HUVEC成网数。结果与对照组比较,A、B和C组在24 h(F=7.99,P=0.009)和48 h(F=75.09,P=0.000)的VEGFA mRNA表达均显著高于对照组,且B组VEGFA mRNA相对表达量在任意时间点均高于A组和C组(P均<0.05)。受牵拉力的三组的VEGFA-165蛋白相对表达量在24 h(F=51.62,P=0.000)和48 h(F=91.69,P=0.000)明显高于对照组。其中,B组VEGFA-165蛋白相对表达量在24 h(0.794±0.045)分别是A组的1.3倍(P=0.012)和C组的1.2倍(P=0.043),且在48 h(1.192±0.042)VEGFA-165蛋白相对表达量分别是A组的1.4倍(P=0.0001)和C组的1.3倍(P=0.0001)。随着时间延长,在24 h(F=131.16,P=0.0001)、36h(F=66.56,P=0.0001)和48 h(F=605.19,P=0.0001)A、B和C组细胞上清液VEGFA浓度明显高于对照组。体外成管实验中,48 h受牵拉力各组成网数均显著高于对照组(F=13.13,P=0.002),而24 h仅B组成网数有明显升高(P=0.029)。结论牵拉力可诱导RPE细胞VEGF过表达,且具有时间效应和潜在的促新生血管形成的功能。

摘要：目的:通过检测17-AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17-AAG对人RPE细胞中PDGFR和EGFR基因表达的调控。方法:体外培养人RPE细胞株。当加入17-AAG并作用0,2,5,10μmol/L及0,16,24,48h后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据PDGFR、EGFR的基因序列,设计PDGFR、EGFR的引物,利用ABI7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct值进行基因表达的相对定量分析。结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17-AAG可以下调PDGFR基因的表达(P<0.05),上调EGFR基因表达(P<0.05)。结论:SYBR Green实时荧光PCR可特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17-AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。

摘要：目的:体外观察17-AAG对人RPE细胞中VEGFA,VEGFB,VEGFR1,VEGFR2基因表达的调控。方法:体外培养人RPE细胞株加入17-AAG并作用不同浓度及时间梯度后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据VEGFA,VEGFB,VEGFR1,VEGFR2的基因序列,设计相应的引物,进行RT-PCR,琼脂糖凝胶电泳用于分析引物的特异性,再利用ABI7300PCR仪和SYBRGreen,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct进行基因表达的相对定量分析。结果:17-AAG可以下调VEGFA,VEGFB和VEGFR1基因的表达,而VEGFR2只有再高浓度17-AAG作用时才下调。结论:17-AAG可抑制RPE细胞VEGF及其受体基因。