摘要：背景:反义药物的研究仍然是当前生物医学领域较为活跃的热点之一,其具有高效特异的优势,作为基因治疗的途径已受到许多研究者的关注。目的:观察脂质体介导角蛋白14反义寡核苷酸对人角质形成细胞K14基因和蛋白表达及体外增殖活性的影响。设计:单一样本观察。单位:解放军第四军医大学西京医院皮肤科。材料:人表皮角质形成细胞、K14寡核苷酸基因片段(全硫代修饰,以上序列均由上海生工生物工程公司合成)。反转录酶、TaqDNA聚合酶均购自Invitrogen公司,K14单抗购自Antibody公司,SABC试剂盒购自博士德。EPlCS-PRO-FILEⅡ流式细胞仪(美国Coulter)。方法:人表皮角质形成细胞原代培养,3～10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,并设空白组作对照。应用流式细胞仪、反转录聚合酶链式反应和免疫组化方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响。主要观察指标:寡核苷酸转染人角质形成细胞后对角质形成细胞增殖和K14表达的影响。结果:①反转录聚合酶链反应产物电泳显示:各组均出现特异的K14基因条带,反义组基因表达明显低于正义组、错义组和空白组。正义组、错义组和空白组K14/β-actin比值相近(P>0.05);而反义组明显低于前述3组(F=47.554,P<0.01)。②免疫组化法检测K14蛋白表达:培养的角质形成细胞均表达一定水平的K14,加入反义寡核苷酸(ASODN)后,K14表达明显减少,20μmol/L浓度的反义寡核苷酸即可显著抑制K14的表达;而对照细胞组K14的表达没有明显变化。③流式细胞仪检测DNA含量变化:经K14反义寡核苷酸处理细胞48h,可见细胞处于G1期细胞比例明显上升(74.6%),S期细胞比例明显下降(19.4%),而正义组,错义组及空白组均无此变化。结论:反义寡核苷酸可特异地抑制K14的合成,从而抑制人角质形成细胞的增殖。

摘要：背景:浸没式体外培养角质形成细胞的技术已得较普遍的应用,但角质形成细胞的体外器官样培养技术尚存在不足。目的:以铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿,提供的气-液交界面体外培养角质形成细胞,以改进角质形成细胞的体外器官样培养技术。设计、时间及地点:体外人工皮肤器官实验,于2008-07/2009-02在河北医科大学第一医院实验室完成。材料:角质形成细胞由解放军第二军医大学王教授馈赠。方法:将浸没式培养的角质形成细胞接种到铺有鼠尾胶原的Transwell培养板套皿当中,Transwell培养板套皿每板有6个孔,每孔当中有一插件,插件悬挂于孔的边缘上,插件底面为一孔径为0.4μm的高分子膜,距离培养板孔的底面有1.5mm的高度,使细胞处于气-液交界面上并培养4周,然后将不同培养时段的培养物进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学、流式细胞仪检测,进而观察细胞分层和分化的状况。主要观察指标:观察细胞的生长状态及分层和分化状态。结果:培养2周的角质形成细胞大部分为单层结构,细胞彼此衔接成铺路石状结构,多数细胞为三角形或多角形结构,细胞核清晰可见,细胞比较饱满。部分区域细胞出现双层结构,表现为单层的角质形成细胞上面铺有连接成条索状的细胞。3周的角质形成细胞大部分为双层结构,异层及同层细胞之间彼此衔接,呈索形结构,细胞核仍然清晰可见,细胞不如2周时饱满。4周的角质形成细胞部分区域为三层结构,且细胞较前变得萎缩,表现为细胞浆减少,细胞核变小。角质形成细胞进行气-液交界面培养至4周,细胞会分为3层,表层的细胞会表达终末分化的标志物角蛋白10。结论:在Transwell培养板套皿膜上,角质形成细胞会出现分层和分化,形成体外的皮肤样器官。

摘要：背景:随着角质形成细胞体外培养技术的建立和发展,皮肤不再被认为是单纯的生理屏障,其在机体免疫和内分泌等方面尤为重要。目的:探讨实验室条件下人体角质形成细胞的培养技术,为角质形成细胞的多方面应用提供可靠的细胞来源。设计:开放性实验。单位:解放军第四军医大学西京医院临床免疫科和皮肤科。材料:实验于2003-03/2005-03在解放军第四军医大学西京医院临床免疫科实验室完成。选取同年4月西京医院泌尿外科门诊收治的1例6岁正常男性术后的包皮为角质形成细胞的来源。方法:①对表皮细胞分离过程采取两步消化法:首先运用离散酶对全层皮肤进行低温消化,将包皮皮片浸入质量浓度为2.5g/L的Dispase酶中,4℃过夜,次日分离表皮;第二步采用胰蛋白酶和乙二氨基四乙酸的混合液进行消化。②采用改良的无血清培养技术进行人体角质形成细胞的培养,培养基为人角质形成细胞无血清培养基+2.5mg/L牛垂体浸出液+5μg/L表皮生长因子+438mg/L谷氨酰胺,其中谷氨酰胺能促进角质形成细胞的生长。③将处于对数生长期的细胞进行人角质形成细胞的冻存和复苏,加入无血清培养基制成细胞悬液,调整细胞密度为5×105/mL接种入75cm培养瓶中传代培养。置于显微镜和透射电2镜下进行细胞形态观察。主要观察指标:①原代和传代细胞的生长情况。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况。③角质形成细胞形态学观察结果。结果:①原代和传代细胞的生长情况:初期细胞悬于培养液中,逐渐细胞贴附于培养皿底部。一般在6～24h内开始贴壁,细胞以圆形为主,随着时间的延长伸展成椭圆型。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落或小集簇,四周可见卫星样表皮细胞增殖,多数细胞为多角形,细胞的均质性和透明度加强。5d左右细胞融合范围可达70%,9d左右细胞融合达90%,11d左右细胞完全融合形成细胞膜片。角质形成细胞可在体外稳定培养2～3个月,细胞形态和生长速度无明显改变。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况:将不同代的角质形成细胞分别冻存于液氮罐中,3个月后进行复苏,发现角质形成细胞的形态和生长速度无明显改变。③角质形成细胞形态学观察结果:显微镜下细胞呈典型上皮样特征,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚折光性好。透射电镜下培养的表皮角质形成细胞胞浆内有大量束状张力丝和张力原纤维,可见线粒体和粗面内质网,胞质周边有短的突起,细胞间有桥粒相连等角化细胞所具有的特点。结论:培养的角质形成细胞在多次传代后仍能够保持正常的形态特征,提示改良的培养角质形成细胞的技术可为实验和临床提供可靠丰富的角质形成细胞来源。

摘要：目的体外分离、培养并鉴定成年小鼠背部皮肤角质形成细胞(KC);对比4种品系小鼠KC的增殖与分化能力。方法剪取4种品系成年小鼠背部皮肤,剥离皮下脂肪组织,0.25%胰蛋白酶消化获得KC;免疫荧光法鉴定KC;显微镜下观察细胞生长状况;设计不同的种板时间和密度,使用CCK-8法、EdU和高内涵法检测细胞增殖活力;通过Western blot检测4种成年小鼠KC分化情况。结果对4种品系成年小鼠背部相同面积的皮肤组织进行胰蛋白酶消化,昆明(Kunming,KM)小鼠提取的KC数量最低,C57BL/6提取的细胞数量最多;BALB/c、KM、裸小鼠分别以8×10^(3)个/孔的密度铺板增殖效率较高,C57BL/6以1.6×10^(4)个/孔的密度铺板增殖效率较高;4种品系小鼠,BALB/c小鼠原代KC较C57BL/6小鼠原代KC增殖能力弱,分化程度差异无统计学意义。结论采用简便易行的方法成功分离并比较4种成年小鼠背部皮肤原代KC的增殖和分化能力,为皮肤相关疾病模型小鼠的品系选择提供一定实验依据。

摘要：目的设计并筛选能高效抑制人角质形成细胞膜上蛋白酶激活受体-2(PAR-2)基因表达的小干扰RNA(siRNA)序列。方法根据人PAR-2 mRNA的序列,设计合成3对针对靶基因的不同siRNA。应用脂质体Lipofectamin2000转染试剂,将3对siRNA转染人角质细胞,半定量RT-PCR技术检测PAR-2mRNA表达水平、Western blot检测PAR-2蛋白表达,以评价干扰效果。结果设计合成的3对PAR-2 siRNA中有2对siRNA可有效抑制PAR-2基因表达,以第2对siRNA效果为佳。结论成功设计合成特异且高效阻断PAR-2表达的siRNA,为进一步应用RNAi技术沉默PAR-2基因奠定实验基础。

摘要：目的探讨下调αB-晶状体蛋白(αB-crystallin)对人皮肤角质形成细胞(Ha Ca T)在应激条件下的存活和凋亡的影响。方法设计并筛选特异性靶向下调αB-crystallin表达的siRNA;噻唑蓝法检测siRNA下调αB-crystallin表达对过氧化氢(H2O2)处理的细胞相对存活率的影响;流式细胞术检测siRNA下调αB-晶状体蛋白表达对H2O2诱导的细胞凋亡率的影响。结果筛选获得可有效下调αB-crystallin表达的siRNA(si-CRYAB-1);si-CRYAB-1下调αB-crystallin表达可降低H2O2处理后的Ha Ca T细胞存活率(P<0.01),并明显增加H2O2诱导的Ha Ca T细胞凋亡率(P<0.05)。结论下调αB-crystallin的表达后,人角质形成细胞在氧化应激条件下的存活能力明显减弱。αB-crystallin可能具有抗人角质形成细胞凋亡的作用。

摘要：目的观察微小RNA-203抑制物(miRNA-203 inhibitor)转染诱导人角质形成细胞向表皮干细胞去分化的可能性及机制。方法(1)取包皮环切术后的人正常包皮组织5例,分离培养人角质形成细胞。倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用免疫细胞化学染色法对人角质形成细胞行角蛋白1(CK1)、CK10、CK19、β1整合素(ITGB1)单克隆抗体检测鉴定。(2)通过脂质体Lipofectamine 2000将miR-203单链抑制物分子转染人角质形成细胞作为实验组,将对照micro RNA抑制物转染人角质形成细胞作为对照组。(3)对转染后的实验组和对照组细胞行CK1、CK10、CK19、ITGB1单克隆抗体检测鉴定;采用实时荧光定量RT-PCR技术检测实验组和对照组转染前后细胞miR-203、P63、CK1、CK10、CK19、ITGB1的mRNA表达量;Western blot法检测实验组和对照组转染前后细胞P63、CK1、CK10、CK19、ITGB1的蛋白表达量。(4)对转染前后miR-203的mRNA表达量与P63的mRNA表达量和蛋白表达量分别行Pearson相关分析。结果(1)转染前人角质形成细胞CK1、CK10表达阳性,转染后CK19、ITGB1表达阳性;(2)实验组转染后细胞miR-203、CK1、CK10 mRNA相对表达量较转染前和对照组显著降低(P0.05)。(3)实验组转染后细胞CK1、CK10蛋白相对表达量显著低于转染前和对照组(P0.05)。(4)miR-203的基因表达与P63的基因和蛋白表达均成显著负相关,转染前相关系数r值分别为-0.907(t=3.730,P=0.038)及-0.956(t=5.644,P=0.012);转染后r值分别为-0.924(t=4.185,P=0.028)及-0.931(t=4.418,P=0.023)。结论 miR-203下调能诱导人角质形成细胞去分化为表皮干细胞,靶基因p63表达上调可能是其重要机制之一。

摘要：目的利用转录组测序技术,筛选重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)]影响角质形成细胞(KC)内表皮生长因子受体(EGFR)表达的差异转录因子,以探讨rhPTH(1-34)治疗银屑病的机制。方法慢病毒转染培养的HaCaT细胞,使之过表达EGFR。rhPTH(1-34)组加入0.01μmol/L rhPTH(1-34),空白组加入等量DMEM溶液。抽提两组细胞RNA,用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳法进行RNA产量和质量检测。合成cDNA,实时定量PCR扩增,对文库有效浓度进行准确定量。上机测序,对所得数据进行处理和分析。用DESeq2软件分析两组数据之间的差异,以|log_2foldchange|≥1且P<0.05作为筛选条件对测序结果进行分析。结果rhPTH(1-34)组和空白组共表达的基因数目12455个,rhPTH(1-34)组单独表达421个,空白组单独表达461个。rhPTH(1-34)组与空白组比较,差异基因共185个,其中108个上调,77个下调。下调中,|log_2foldchange|最高的5个差异转录因子为ZNF525、ZNF774、ZNF576、ZBTB42和POU4F1(P<0.05)。其中ZNF774、POU4F1主要涉及Notch2、MAPK信号通路的调节。结论rhPTH(1-34)抑制KC增殖可能与下调ZNF525、ZNF774、ZNF576、ZBTB42、POU4F1表达有关。其中ZNF774、POU4F1可能与KC增殖相关。

摘要：目的探讨白细胞介素1α(interleukin-1α,IL-1α)对人永生化角质形成细胞(HaCaT)、水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)和蛋白表达的影响及其意义。方法应用1、10、100μg/L IL-1α处理HaCaT,培养24 h后,实时荧光定量反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及免疫印迹法(western blot assay)分析检测其AQP3 mRNA和蛋白表达变化。应用10μg/L IL-1α处理HaCaT,培养6、12、24 h,检测其蛋白表达变化。采用单因素4水平设计定量资料的方差检验分析组间总体差异。组间比较采用SNK-q检验。结果 IL-1α下调HaCaT细胞AQP3 mRNA的表达,且该作用具有剂量依赖性。1μg/L IL-1α可以下调其表达,在100μg/L时,其作用更为明显(F=37.86,P<0.000 1)。随浓度增加,IL-1α对AQP3蛋白表达的抑制作用亦增加,以100μg/L组最明显。10μg/L的IL-1α在处理后6 h降低了HaCaT细胞AQP3蛋白的表达,但随时间延长,其表达又有上升。结论 IL-1α可以下调HaCaT细胞AQP3 mRNA及蛋白的表达,这一作用可能和皮肤光老化的发生相关。

摘要：背景:组织工程皮肤对于大面积皮肤缺损的修复与重建具有重要作用,含有中药的组织工程皮肤支架对于细胞黏附及创面感染控制的作用研究并不多见。目的:利用角质形成细胞与成纤维细胞筛选生肌液应用浓度,观察生肌液-明胶-壳聚糖载药皮肤支架对细胞黏附及生物相容性影响。设计、时间及地点:以角质形成细胞与成纤维细胞为观察对象,随机对照实验,于2005-02/08在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。材料:健康大耳白兔1只,用于获取皮肤种子细胞;生肌液、当归提取液及生地提取液(自行提取,1.5g/mL),明胶-壳聚糖支架及生肌液-明胶-壳聚糖支架由天津大学提供。方法:①以dispaseⅡ-胰蛋白酶-EDTA消化法获取第3代角质形成细胞与成纤维细胞。②实验分为5组,对照组为普通培养液(含体积分数为0.1胎牛血清的基础培养基);生肌液组为含有生肌液质量浓度分别为5,6,8,12g/L的培养液;当归组为含有当归提取液质量浓度为8g/L的培养液;生地组为含有生地提取液质量浓度为8g/L的培养液;表皮生长因子组为含有10μg/L表皮生长因子的培养液;分别用于培养第3代角质形成细胞和成纤维细胞,于1,3,5,7d用MTT法检测细胞的增殖情况。③制备基质中生肌液质量浓度分别为50,60,80,120g/L的载药支架组,将上述细胞在支架上培养,分别于7,14d用半定量方法观察细胞与支架的黏附情况。④60,80g/L载药支架组种植角质形成细胞,分别于4,7,14d取材,进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察。主要观察指标:①生肌液对皮肤种子细胞增殖的影响。②载药支架对细胞黏附的影响。③细胞与载体的相容性。结果:①MTT检测结果表明,5、6、8g/L的生肌液组细胞增殖较快,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.05)。②第3代角质形成细胞与成纤维细胞在60、80g/L的载药支架上可获得较多增殖。③支架上的角质形成细胞形态良好,与支架紧密贴附,药物对细胞无明显毒性作用。结论:生肌液质量浓度为60,80g/L的明胶-壳聚糖载药支架可有效促进角质形成细胞和成纤维细胞的黏附和增殖。