摘要：目的构建展示角质细胞生长因子（KGF）噬菌体活性肽，检测其促表皮细胞增殖的作用。方法选择4个KGF序列，设计引物；用反转录．PCR法获得3个KGF序列（Pl、P2和P4），直接合成1个KGF序列（P3）；将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3中；用噬菌体展示技术，将KGF基因片段展示于噬菌体表面；用四甲基偶氮唑盐（MTF）法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用，测定其在570nm的吸光度（A）值，用免疫荧光法检测其细胞亲和力。结果获得4种KGF基因，构建在噬菌粒pComb3中；通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面。MTr检测的吸光度（A）值结果显示阴性对照组（0．293±0．017）与KGF对照组（0．520±0．043）及4种KGF噬菌体活性肽组（P1～4）（0．469±0．057、0．441±0．048、0．438±0．035、0．446±0．037）间差异均有统计学意义（均P〈0．01），免疫荧光检测结果显示KGF和4种KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力。结论构建展示的KGF噬菌体活性肽能够显著促进表皮细胞增殖。

摘要：背景： 关于消化外套膜组织获得的细胞悬液是否能在体外有效地扩增形成珍珠囊以及最终形成珍珠仍存在争议，且这方面研究不多。目的：建立一套有效的马氏珠母贝外套膜组织细胞体外分离及培养的技术和方法，同时探讨体外形成具有完整结构和分泌功能的珍珠囊并最终生成优质珍珠的最佳方法。设计、时间及地点：单一样本观察，于2008-08/12在广西中医学院基础医学院完成。材料：贝龄1.0~2.0岁马氏珠母贝由广西北海市营盘珍珠实业有限公司提供，自配改进的海水贝类平衡盐溶液（MWBSS）；自制珍珠贝血清和珍珠贝体液；角质细胞生长因子为美国Sigma公司产品。方法：使用2.5 g/L胰蛋白酶消化马氏珠母贝外套膜组织，收获的细胞使用M199（含体积分数10%胎牛血清）培养基进行培养，并在其中加入10 μg/L的角质细胞生长因子、10%自制的珍珠贝体液和贝血清，持续培养30 d。主要观察指标：细胞生长特性和生长状态。结果：体外培养的珍珠外套膜上皮细胞增殖迅速，分泌功能旺盛，肌肉细胞增殖能力强，并最终能包裹外套膜上皮细胞，形成结构较完整、分泌能力较强的珍珠囊。结论：使用改进的培养技术和培养体系中添加角质细胞生长因子在体外培养珍珠外套膜组织细胞，可获得生长状态和分泌功能均较好的珍珠囊。

摘要：目的:构建同时携带低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF-KGF),观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1αcDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100 MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48h ELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/mL,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/mL。结论:成功构建了腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。

摘要：通过设计使用昆虫密码子，在草地贪夜蛾9（Spodoptera frugiperda 9，Sf9）细胞中表达重组人角质细胞生长因子1（rhKGFl）的3种形式：带天然信号肽、不带天然信号肽或截去23个氨基酸。免疫印迹结果表明这些rhKGFl蛋白都能被人抗KGFl抗体识别。感染次数和收获时间对蛋白产量、质量和细胞毒性有显著影响。在昆虫细胞中，由天然的信号肽介导KGFl分泌，并在感染后60h达到最大值。