摘要：目的构建汉坦病毒(HV)Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体,探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCmZ10M为模板设计引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段,将G2片段克隆入pUCmT质粒载体,碱法提取质粒pUCmZ10G2,酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa,构建重组体pFastBacHTaZ10G2,重组体转化感受态细胞***10Bac后,经2轮筛选,提取重组质粒转染昆虫细胞sf9,并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HVZ10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒,转染昆虫细胞表达出G2蛋白,与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应,昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清,与全病毒细胞抗原片的符合率为95%。结论成功构建HVZ10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体,并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。

摘要：目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18L1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAL1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAL1肌肉注射BALBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18L1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18L1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。

摘要：本实验旨在对猪新基因FAM134B基因进行全长克隆,尝试有效沉默FAM134B基因的干扰表达载体的构建和筛选,并筛选出沉默FAM134B基因的稳定阳性细胞。设计合成3对FAM134B基因的特异性发夹siRNA干扰片段,将其克隆入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默FAM134B基因的siRNA表达载体FAM134B-1、FAM134B-2和FAM134B-3,采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染肌内前体脂肪细胞,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果,并进一步用G418进行了稳定转染siRNA的肌内前体脂肪细胞筛选。结果表明:FAM134B基因的全长克隆成功,其siRNA表达载体构建正确,通过稳定筛选后,干扰效率较高的FAM134B-3表达载体和稳定转染FAM134B-3的细胞为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞,干扰效率达65.0%。本研究成功克隆了新基因FAM134B的全长以及构建了有效沉默FAM134B基因表达的干扰载体,并筛选出了稳定沉默的阳性肌内前体脂肪细胞,为进一步研究FAM134B基因在脂肪沉积中的功能研究奠定了基础。

摘要：本实验旨在观察乳腺癌相关抗原基因1（BRCAA1）在MCF-7细胞发生发展过程中的作用，现报道如下。一、材料与方法1．材料：人乳腺癌细胞株MCF-7、质粒转染试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒、细胞凋亡试剂盒、BRCAA1-短发夹RNA（shRNA）质粒：BRCAA1-shRNA1（BRCAA1-homo-536）：5＇-GCACTGATGTGAGTGCTAAATITCAAGAGAATTTAGCACTCACA-TCAGTGCT3’；BRCAA1-shRNA2（BRCAA1-homo-718）：5’-GCATATCAGGAAGCTGTTATCTTCAAGAGAGATAACAGCTTCCT-GATATGCTT-3’；BRCAA1-shRNA3（BRCAA1-homo-893）：5’-GCACTCCACTCATGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCTATGACT-GGAGTGCTT-3’；BRCAA1-shRNA4（BRCAA1-homo-1371）：5’-GGAGGATAATAGCAGTGAAGATTCAAGAGATCTTCACTGCTATT-ATCCTCCTT-3’。2．方法：MCF-7细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基。将设计好的4组质粒转染细胞，并设立空白对照组（未转染组）和阴性对照组（shRNA-NC）。细胞计数法（CCK-8）检测干扰质粒对乳腺癌细胞增殖的影响，选择增殖抑制率最佳的质粒组进行流式细胞学检测。

摘要：目的探讨RNAi技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1(MuRF-1)基因表达的效果,筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。方法根据大鼠MuRF-1基因的mRNA序列,设计4组干扰序列,即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000转染试剂将siRNA重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6,于转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR和Western blot或免疫印迹检测其对MuRF-1表达的抑制效果。MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA和蛋白质数据以x±s表示。对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析;多个样本均数的两两比较用LSD检验。结果(1)实时定量PCR显示四组干扰质粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF-1的mRNA的抑制率在转染后48 h分别为67﹪、31﹪、11﹪,20﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.527,P=0.024);72 h分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=19.088,P0.05)。四对序列中,以siRNAMuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显。蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。结论成功筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒,即siRNA MuRF1-Ⅰ,为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。