摘要：目的 探索实验室规模生产质粒dna(plasmid dna,pdna)的制备工艺。方法 选用质粒pEGFP-N1E. coli Stbl3菌株,用最陡爬坡试验(plackett-burman,PB)筛选出影响质粒产量最显著因素,响应面法优化重组菌高产发酵条件。采用碱裂解,浓缩质粒,通过凝胶、亲和、离子等层析分离纯化pdna,并对所纯化的pdna进行质量评价。结果 用PB试验和响应面试验设计筛选出的关键因素是:酵母提取物20 g/L,甘油6 g/L,接种物浓度吸光度(optical density,OD)=0.014。在最佳条件下进行3次平行发酵,生物量OD 600达28.07±2.01,质粒产量(21.34±1.31)mg/L。pdna纯度(A260 nm/A280 nm)为1.91±0.02。内毒素含量小于0.005 EU/g dna;几乎检测不到蛋白质及细菌基因组dna残留,达到相关质量标准。结论 本研究采用的制备工艺可生产出高质量的p dna。

摘要：目的对检测质粒dna中宿主菌基因组dna含量的Southern blot和Real-time PCR法进行比较。方法PCR扩增宿主菌染色体dna的16SrRNA片段,以地高辛标记回收的目的片段为探针,对提取的质粒pcdnaH进行Southern blot,同时根据16SrRNA基因序列设计探针,建立Real-time PCR反应体系和标准曲线,分别检测质粒中宿主菌基因组dna的含量。结果应用Southern blot和Real-time PCR检测质粒pcdnaH中宿主菌基因组dna的含量,结果均符合WHO相关标准。结论两种检测方法各有优缺点,均可用于检测质粒dna中宿主菌基因组dna的残留,可根据不同情况,采用不同方法或配套使用。

摘要：中国计量科学研究院(NIM)利用数字PCR技术针对国际比对样品质粒dna,通过设计2对特异性的引物和探针、优化PCR扩增体系、排除PCR mastermix中的dna污染,成功建立了定量该质粒dna的数字PCR方法。比较了采用单重PCR和双重PCR方法定量结果之间的差异,最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定。对线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度(k=2)为(8.06±0.55)×10~3 copies/nag,该结果在比对参考值不确定度范围内,且与参考值非常接近。

摘要：质粒ＤＮＡ有重要的基因调节性能，直接注射裸露或用脂质体包埋的质粒ＤＮＡ常需要大量的质粒ＤＮＡ。当前广泛被采用的碱溶从细胞中提取质粒的方法有不少问题，其中纯化工艺产量较低是质粒大规模生产的主要瓶颈，因此设计和开发新型质粒生产方法具有重要的意义。

摘要：基因疗法是用于预防及治疗癌症、艾滋病和囊性纤维变性等疾病的有效方法。给予治疗基因的方法之一是直接注射裸露或脂质体包裹的质粒dna,但需要大量质粒dna。当前在基因治疗用药物质粒dna的大规模生产工艺的设计及操作中还存在一些问题和障碍。

摘要：阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种．会对新生儿健康产生严重危害。目前，上海市计量院化学所开展的国家质检总局《阪崎肠杆菌检测质粒dna标准物质的研制》科研项目，设计并研制了4种阪崎肠杆菌质粒dna标准物质。可为多种阪崎肠杆菌PCR．

摘要：为了得到具有核酸切割功能的人工核酸酶,设计合成了二乙烯三胺单齿、双齿、四齿配体,目标化合物的结构经红外、核磁氢谱、碳谱和电喷雾质谱确认。在磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲溶液中对质粒dna切割活性的初步实验结果表明:在多齿配体的锌(Ⅱ)配合物存在下,37℃保温48 h后,质粒dna由Form Ⅰ断裂为Form Ⅱ,即合成的目标化合物有明显的切割活性。通过T4连接酶实验证明了目标化合物对dna的切割为水解切割机制。

摘要：目的研制一种dna芯片,结合多重PCR方法快速检测泌尿生殖道炎症3种病原体及其耐药类型。方法根据泌尿生殖道病原体淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体的基因保守序列设计引物和探针,分别检测3种病原体;根据淋球菌gyrA、parC和16srRNA基因序列突变位点设计引物和探针,分别检测淋球菌对喹诺酮类药物和大观霉素的耐药性;根据淋球菌和解脲脲原体的共同tetM基因序列设计引物和探针,检测对四环素的耐药性。制备芯片,对152份泌尿生殖道拭子提取dna进行7重PCR扩增,并且Cy5荧光标记包含上述基因序列的目的dna片段,与固定在芯片上的探针杂交,芯片信号分析系统Scanarray4000在635nm处扫描并分析结果,并与临床检查结果比较。结果dna芯片敏感性是0.01fg质粒dna。152份泌尿生殖道炎症拭子其病原体种类及其耐药类型全部可用dna芯片检测出来,与目前临床检查结果有较好的一致性(K>0.8)。结论研制的dna芯片结合7重PCR方法快速检测泌尿生殖道淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体3种病原体及其对喹诺酮类药物、大观霉素和四环素的耐药类型,具有快速、高特异性和高灵敏度,可以应用于临床检测。

摘要：以原癌基因Kras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒dna为研究模型,采用SYBRGreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明:在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBRGreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.

摘要：以巯基壳聚糖(TCS)为基因载体,采用离子交联法制备能用于基因口服研究的质粒dna-巯基壳聚糖纳米粒(pdna-TCS-NPs).分别以TCS质量浓度、三聚磷酸钠(TPP)质量浓度、pH值和转速为考察对象,以pdna-TCS-NPs粒径和Zeta电位为评价指标,采用4因素3水平Box-Behnken效应面法筛选最佳制备工艺,并对其外观形态,包封率等体外性质进行考察.结果表明:TCS质量浓度为0.80mg·mL^(-1),TPP质量浓度为0.65mg·mL^(-1),pH=5.3,转速为2 000r·min^(-1)是最优制备工艺,可制得粒径为(134.21±1.34)nm,Zeta电位为(24.36±0.29)mV,包封率在(80.26±0.56)%,形状规则且分散良好的pdna-巯基壳聚糖纳米粒;Box-Behnken实验设计可用于预测和优化pdna-TCS-NP制备工艺优化筛选.