摘要：随着转基因技术的成熟,转基因生物越来越多,关于转基因生物的争议也越来越受到人们的关注。建立一套能够简便、快速、准确的检测转基因林木的外源基因技术,对转基因林木的研究有重要意义。采用灵敏、快速的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立一套以Bt Cry1Ac或Npt II基因为靶标的转基因林木的检测方法。针对靶标基因的6个区域设计4种特异引物,优化LAMP-PCR反应体系中的各个成分,根据直接观察产物中焦磷酸镁的沉淀情况、Gold View核酸染色剂对其产物染色情况来判断反应结果并与将产物经过1%琼脂糖电泳的情况进行对比。比较LAMP-PCR和常规PCR两种不同检测方法的灵敏度。对转基因杨树不同无性系中多种外源基因进行检测。筛选出了最佳的引物,确定出了最优的反应体系:3 mmol/L Mg2+、1.4 mmol/L Bst、1.4 mol/L Betaine、7:1的10μmol/L内外引物比、2μL10 mmol/L d NTP、以及2μL浓度为200 ng/μL的DNA模板。在PCR仪65℃等温条件下保温90 min,可直接观察到焦磷酸镁的白色沉淀;经过Gold View核酸染色剂染色,可在紫外灯下观察到荧光绿色;经过1%琼脂糖电泳的检测,可观察到清晰的弥散状条带。通过对比试验得出LAMP-PCR的灵敏度比常规PCR要高。对实验室多个转基因杨树无性系目的基因的检测,证明了LAMP-PCR在转基因林木外源基因检测中的较高可靠性。本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测转基因林木,建立了一套更简便、灵敏、快速、可靠的转基因林木的LAMP-PCR检测方法。该技术在恒温65℃的条件下保温90 min即可完成转基因林木的检测,既节省了时间,又降低了成本,为转基因林木的检测研究提供了一种新的技术。

摘要：【目的】转基因植物大田种植可能存在风险,本研究从不同外源基因在转基因杨树中的遗传稳定性及向土壤微生物转移的风险、转基因杨树对土壤微生物群落影响以及对于野生植物的化感作用4个方面进行综合分析,通过评估3类转基因南林895杨田间释放的安全性,为转基因林木的安全评估及田间释放提供参考。【方法】将3种编码不同抗性蛋白的外源基因(PeTLP、Cry1Ac、AtGols)分别构建到植物表达载体pGWB9中,采用根癌农杆菌LBA4404侵染南林895杨叶盘进行转化,筛选阳性植株,获得3类转基因南林895杨(TLP抗病系列、Bt抗虫系列、Gols抗逆系列)共13个株系,于温室培养1年,剪取茎段在试验田中进行扦插种植。田间种植采用随机区和裂区设计2种方式,在20个月的试验周期内,记录试验地环境条件及转基因杨树生长状况;定期采集各转基因系列及对照组南林895杨叶片及周围土壤样品,通过PCR技术检测3种外源基因在转基因杨树中的遗传稳定性,并提取土壤微生物总DNA进行3种外源基因的PCR检测,对外源基因向土壤微生物转移的风险进行评估;采用平板计数方法分析土壤微生物群落组成及变化情况,评估转基因杨树对土壤微生物群落的影响;利用“三明治”方法和莴苣种子模拟转基因杨树对于野生植物的化感作用,记录并分析莴苣种子胚根和胚轴的发育水平,评估转基因杨树对于生态多样性的影响。【结果】试验地环境条件相对稳定,未出现极端天气影响杨树生长,转基因南林895杨的生长趋势与对照组(南林895杨)的生长趋势基本一致,3类转基因杨树的高与各自对照组之间的差异未达到显著水平;3种外源基因均稳定存在于转基因南林895杨中,未发现向土壤微生物中转移的现象;土壤微生物数量受气温和降水量影响显著(P<0.05),转基因杨树对土壤微生物的群落结构和生长未产生显著影响;3种外源基因转化的南林895杨叶片对于莴苣种子胚根和下胚轴的生长并无显著影响。【结论】本研究中Bt系列、TLP系列和Gols系列3类转基因南林895杨在田间试验中无明显的环境危害。

摘要：【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨3个株系(A1、A2、A3)和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨3个株系(B1、B2、B3),通过PCR技术对转基因107杨中外源基因进行检测和验证,通过实时荧光定量PCR对Bt基因的转录丰度进行检测,利用ELISA技术对转基因107杨不同时间、不同部位毒蛋白含量进行检测。【结果】PCR检测结果显示,转基因107杨均能扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,阴性对照未扩增出特异性条带,证明外源基因在转基因107杨中稳定存在;实时荧光定量PCR检测结果表明,2种Bt基因在转基因107杨中均能稳定表达,Cry1Ac基因的转录丰度在2.1×10^4~5.1×10^4之间,Cry3A基因的转录丰度在2.8×10^6~5.6×10^7之间,Cry1Ac基因和Cry3A基因转录丰度无相关性;ELISA技术检测结果显示,转基因107杨中均检测到Cry1Ac和Cry3A毒蛋白存在。2种Bt基因转录丰度和毒蛋白含量无相关性,但2种Bt毒蛋白含量之间呈现出正相关关系。转2种不同载体的107杨6、7月份2种Bt毒蛋白的含量较低,8月份急剧上升,Cry1Ac毒蛋白的含量均在9月份达到峰值,Cry3A毒蛋白含量均在8月份达到峰值,10月急剧下降。8月份不同部位(上、中、下)的叶片Bt毒蛋白含量未表现出一致性规律,不同部位(上、中、下)木质部的Bt毒蛋白含量也未呈现出一致性规律。【结论】转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨不同株系间2种Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因;2种Bt毒蛋白在各株系间存在显著差异,Cry1Ac毒蛋白含量极低,Cry3A毒蛋白含量极显著高于Cry1Ac,与转录水平检测结果一致。2种不同载体之间Cry1Ac基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量无明显差异,Cry3A基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量也无明显差异。在转基因107杨整个生长季中,Cry1Ac和Cry3A平均毒蛋白含量变化趋势基本一致,呈单峰模式。