摘要：【目的】为齐整小核菌代谢工程研究建立高效的转录单元组装系统。【方法】通过应用Golden Gate技术,以mobius assembly为基础,分别设计并构建DNA元件标准化接口改造、单转录单元组装、应用质粒(多转录单元)组装等功能的载体,从而形成一套完整的多转录单元组装系统。【结果】构建了2个用于DNA元件标准化接口改造的Level 0载体,4个用于单转录单元组装的Level 1载体,4个用于应用质粒组装的Level 2载体和13个应用质粒组装的辅助质粒。然后应用此系统为齐整小核菌组装了若干经过标准化接口改造的DNA元件质粒、单转录单元质粒和硬葡聚糖相关基因的功能分析质粒。所构建的最终应用质粒可以同时适用于齐整小核菌的根癌农杆菌介导转化法、电穿孔转化法和原生质体转化法。【结论】此质粒系统具有强大的DNA设计、组装和容纳能力,为未来齐整小核菌代谢工程和功能基因组学研究提供了高效的质粒构建技术平台。

摘要：为研究运动发酵单胞菌合成生物学及代谢工程,评估运动发酵单胞菌内源启动子及终止子,需要建立一种方便有效的多基因代谢途径组装方法.通过Golden Gate方法构建了一个含有运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶2编码基因启动子区(P_(adh2))、丙酮酸脱羧酶编码基因终止子区(T_(pdc))和绿色荧光蛋白开放阅读框(gfp)的人工转录单元.将含有IIS型限制内切酶Bbs I识别和酶切序列的特异性接头添加到P_(adh2)、T_(pdc)和gfp序列两侧,从而保证在一个反应体系中完成上述3个生物元件的酶切和连接,因此该技术被称作"One-POT".插入上述人工转录单元的穿梭质粒导入大肠杆菌和运动发酵单胞菌后可检测到发出绿色荧光的细胞.结果显示通过Golden Gate方法可有效组装转录单元所需DNA生物元件.本研究不仅可为运动发酵单胞菌合成生物学和代谢工程研究,尤其是设计多基因代谢途径组装方面提供技术工具,也可为评估运动发酵单胞菌内源启动子和终止子提供一种有效方法.