摘要：目的通过转录因子sp1基因克隆以及真核表达载体的构建，为探讨转录因子sp1在牙釉质发育的分子调控奠定基础。方法根据引物设计原则设计sp1基因的PCR引物，以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得eDNA为模板，进行PCR扩增，用PCR法扩增得出含有EcoRⅠ和XbaⅠ的sp1目的基因连接到pcDNA3．1／myc-HisA真核表达载体上。结果经过PCR引物扩增得到2343bp基因片段，将获得的重组质粒pcDNA3．1／myc-HisA-sp1双酶切分析鉴定，测序结果与GenBank登录基因完全一致。结论成功实现了sp1基因克隆及表达载体的构建，为以后研究转录因子sp1在牙釉质发育的分子调控方面奠定基础。

摘要：目的 研究非对称小干扰RNA（asymmetric structure of interfering RNA,aiRNA）沉默泛素特异肽酶22（ubiquitin specficpeptidase 22,Usp22）基因对膀胱癌EJ细胞增殖的影响及其相关机制.方法 2010年8月至2012年3月,我们设计并合成Usp22 aiRNA及阴性对照aiRNA（NC-aiRNA） Usp22 aiRNA序列结构包括长度分别为15 bp和21 bp的正义链和反义链,将此aiRNA命名为Usp22 aiRNA（15/21）,利用脂质体转染膀胱癌EJ细胞.实验分3组：对照组、NC-aiRNA组和Usp22 aiRNA（15/21）组转染后48 h,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法分别检测Usp22、Myc、cyclin D1和cyclin E1基因mRNA和蛋白表达水平,噻唑蓝（MTT）法检测EJ细胞的增殖活性,荧光素酶报告基因检测系统检测Myc启动子活性 利用染色质免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation,ChIP）分析沉默Usp22基因后转录因子sp1与Myc基因启动子的结合情况结果 与对照组相比,转染Usp22 aiRNA（15/21） 48 h后EJ细胞中的Usp22、Myc、cyclin D1和cyclin E1的mRNA和蛋白表达水平分别下调了（87.4±5.2）％和（91.2±7.3）％、（69.2±4.3）％和（61.0±6.6）％、（78.5±4.1）和（67.4± 5.5）％、（81.0±5.5）％和（78.3±4.0）％（P＜0.05）.MTT结果显示,Usp22aiRNA（15/21）组EJ细胞的增殖活性明显受到抑制,在24、48、72和96h4个时间点的细胞生长活性分别为（85.4±5.7）％、（71.3±8.4）％、（52.5±6.7）％和（45.8±6.4）％（P＜0.05）.荧光素酶报告基因检测结果显示,Usp22 aiRNA（15/21）组Myc启动子的转录活性下调（65.5±4.2）％（P＜0.05）.ChIP结果进一步显示,沉默Usp22抑制了转录因子sp1与Myc启动子的结合,Usp22 aiRNA（15/21）组sp1与Myc启动子的结合能力相比对照组下调了（48.0±3.2）％（P＜0.05）.结论 Usp22 aiRNA（15/21）可能通过抑制Myc基因启动子与转录因子sp1的结合,下调Myc的表达,从而抑制膀胱癌EJ细胞的增殖.

摘要：目的 观察Ki-67启动子内能与细胞核蛋白结合的转录因子sp1结合位点,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 提取Hela细胞核蛋白.针对Ki-67启动子内4个潜在sp1位点区域A1（-198～-172）、A2（-170～-144）、A3（-63～-37）、A4（-14～＋12）,以及没有sp1结合位点的阴性对照区域C（-117～-91）,设计相应的sp1一致性寡核苷酸探针和sp1突变性寡核苷酸探针,凝胶阻滞电泳实验（EMSA）验证sp1探针与Hela细胞核蛋白的结合活性.结果 EMSA显示A2、A3、A4一致性探针均可以和Hela细胞核蛋白结合,这种结合可以被相应的100倍浓度非标记的一致性探针竞争抑制,不能被100倍浓度的非标记的突变性探针所抑制.出现结合带的反应中加入sp1抗体后观察到明显的Supershift现象.A1和C相应探针不能和Hela细胞核蛋白发生结合反应.结论 Ki-67启动子-170～-144、-63～-37和-14～＋12区域上存在能与肿瘤Hela细胞核蛋白结合的sp1结合位点.

摘要：目的:研究针对转录因子sp1的圈套寡脱氧核苷酸(Decoy-Oligodeoxynucleotide,Decoy-ODN)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)的活力和Ⅲα1胶原基因表达的影响,探讨圈套寡脱氧核苷酸用于病理性瘢痕基因治疗的可能性及机理。方法:设计合成针对sp1的特异性哑铃形Decoy-ODN。用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞。分别用流式细胞仪检测ODN转染效率,激光共聚焦显微镜观察ODN在细胞中的分布,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证ODN与sp1的特异性结合。用WST-8检测ODN对细胞活力的影响。用RT-PCR检测ODN对细胞胶原基因表达的抑制作用。结果:分别转染25nM、50nM、100nM、150nM sp1 Decoy-ODN,48h后,细胞活力依次为0.9331±0.0203、0.7479±0.0868、0.577±0.0347、0.4703±0.0147;转染100nMsp1Decoy-ODN可明显抑制Ⅲα1胶原mRNA的表达(P<0.01),抑制效果达60%。结论:Decoy-ODN可以通过拮抗核转录因子sp1的活性而抑制NIH3T3细胞的活力和Ⅲα1胶原基因的表达。