摘要：采用正交设计（Ｌ９（３４））对影响Ｍ１３ｍｐ１８转染其宿主大肠杆菌ＴＧ１的３个因素：热激温度、时间和ＤＮＡ量各设３个水平进行优化。直观分析表明：热激温度是主要的，其次是ＤＮＡ量，最后是热激时间。直观分析确定的较优转染条件为：热激温度４４℃、时间１２０ｓ、ＤＮＡ量６００ｐｇ。验证转染试验表明：在该条件下Ｍ１３ｍｐ１８对ＴＧ１的转染效率较高。

摘要：设计带BamHⅠ酶切标记位点的引物,PCR扩增鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pGEM-T Easy载体中,获得GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆质粒pGEMT-2GoCV。EcoRⅠ酶切线性化pGEMT-2GoCV,与脂质体混合转染GoCV阴性鹅胚和雏鹅,常规PCR检测发现GoCV在转染鹅体内增殖,鹅胚转染组于孵出第2周和第4周检出血清阳性,且其中一个个体于4周龄扑杀时检出法氏囊阳性,雏鹅转染组于转染后2周检出血清阳性。试验进一步对扩增片段进行了BamHⅠ标记位点的检测,并应用GoCV实时荧光定量PCR方法对转染阳性样品进行了定量,结果显示阳性法氏囊组织中病毒含量为1.57×106拷贝/mg,阳性血清含病毒拷贝数在3.52×104～5.92×105拷贝/μL。综上,本试验构建的GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染鹅胚和雏鹅并增殖出带标记的GoCV克隆。

摘要：目的构建pEGFP—N1—TGF-β1重组质粒，利用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）中，为构建实验性干预急性肺损伤的真核表达载体及转染原代培养AEC-Ⅱ提供方法学基础。方法应用含人TGF—β1CDS的质粒，设计PCR引物扩增出其CDS片段，将其与空质粒pEGFP—N1用Xhol和EcoRI双酶切，T4DNA Ligase连接双酶切产物，将连接产物转化入DH5α中，培养16h后抽提质粒，PCR法鉴定和测序证实TGF—β1 CDS序列正确。采用Lipofectamine 2000脂质体介导转染，将新生猪AEC—Ⅱ原代培养48h至细胞融合80％-90％，换为无血清培养液；将质粒DNA（pEGFP—N1-TGF—β1重组质粒）和Lipofectamine 2000加至DMEM培养液中混匀，置于培养箱中培养4—6h，更换为完全培养液；转染24—48h后，荧光显微镜下观察细胞EGFP表达水平。结果PCR法及测序鉴定证实TGF—β1 CDS序列正确，重组质粒构建成功，采用Nanovue超微量分光光度计测浓度质粒浓度为195．5μg/mL，转染后48h在荧光显微镜下可见细胞有绿色荧光表达，证实已将其成功转染入原代培养的AEC—Ⅱ中。结论成功构建了pEGFP-N1—TGF-β1真核表达载体，并首次采用脂质体介导方法将重组质粒转染入原代培养的新生猪AEC—Ⅱ中，为开展其他实验性干预ALI的基因转染并进一步研究其修复作用及转归提供方法学基础。

摘要：目的　观察人白细胞介素 2 (IL 2 )基因在皮肤角朊细胞中的稳定表达及分泌情况。方法　lipofectamine介导法转染 ,以G4 18筛选出阳性克隆并做扩大培养 ,用DNA斑点杂交、RNA斑点杂交、细胞铺片原位杂交、免疫组织化学、Western印迹杂交分析及噻唑蓝 (MTT)法检测外源基因在角朊细胞内的表达及分泌情况。结果　DNA斑点杂交、RNA斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色均显示转染组有阳性信号 ;Western印迹杂交分析显示转染组细胞在相对分子质量为 15 0 0 0处出现一条特异性着色带 ,其位置与IL 2的相对分子质量一致 ,IL 2表达时间可持续在 1个月以上 ;MTT法检测结果显示 ,第二代、第四代转染细胞培养上清中IL 2的活性分别是 2 7 7U/ml和 15U/ml。结论　外源基因在角朊细胞内能够持续、稳定表达基因产物 ,并能分泌具有生物学活性的蛋白质。用角朊细胞作靶细胞进行基因转染、基因表达、甚至基因治疗的设计是可行的。

摘要：目的研究慢病毒载体基因在肝脏内转染的有效途径。方法本实验根据大鼠消化系统解剖,设计利用经回盲部回结肠静脉穿刺置管至门静脉作为转染途径。通过观察对比尾静脉转染途径大鼠肝脏荧光蛋白表达、基因表达及转氨酶变化情况,探讨不同转染方法的有效性和安全性。结果门静脉转染组和尾静脉转染组大鼠均存活。转染后96 h慢病毒载体携带绿色荧光蛋白在门静脉转染组肝脏呈高表达,14 d后仍有持续表达;尾静脉转染组术后96 h荧光蛋白表达较门静脉组弱,14 d后几无持续表达。RT-PCR检测转染基因LXRα-RNAi效率:转染组LXRαmRNA表达均有下调,门静脉转染组LXRα基因敲减率明显高于尾静脉转染组(0.135±0.002 vs 0.713±0.036,P<0.05),两组血清ALT比较差别无统计学意义。结论经门静脉灌注是基因转染的有效途径,经回盲部回结肠静脉属支穿刺置管可在保证大鼠存活的情况下提高基因转染率,且对肝功能无明显损害,是值得推广的方法。

摘要：目的构建大鼠少突胶质细胞转录因子2(Olig2)的慢病毒表达载体,并转染少突胶质前体细胞(OPCs),观察Olig2过表达对OPCs向少突胶质细胞(OLs)分化的影响。方法设计合成PCR引物,从大鼠pEGFP-N3-Olig2表达质粒中扩增并克隆大鼠Olig2-EGFP片段,将其插入到pLenti6.3慢病毒表达载体中,形成pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体。将其与包装质粒混合后共转染293T细胞,包装产生慢病毒后感染培养的OPCs,观察Olig2在感染细胞中的表达并鉴定其表达对OPCs向OLs分化的影响。结果成功将大鼠Olig2-EGFP片段克隆入pLenti6.3慢病毒表达载体,构建的pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达载体能够高效表达。与空质粒转染的OPCs相比,重组质粒转染的OPCs体外诱导分化后产生更多的OLs(n=5,P<0.01)。结论成功建立大鼠pLenti6.3-Olig2-EGFP慢病毒表达系统,慢病毒介导的Olig2过表达促进大鼠OPCs向OLs分化。

摘要：目的观察腺病毒介导的人EGF（Ad-hEGF）基因转染人表皮细胞的合适条件及转染对该细胞生物学特性的影响。方法取包皮环切术后弃用的新鲜人体包皮组织，通过酶消化法分离人表皮细胞，传代培养，采用第3代细胞进行以下实验。（1）按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为未转染组及5、20、50、100、150、200倍转染组，每组3孔。未转染组不转染Ad-hEGF基因，后6组分别按感染复数（MOI）5、20、50、100、150、200转染Ad-hEGF基因。转染24、48、72h，倒置相差显做镜下观察细胞形态，倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达。（2）另取3个批次细胞，分别同前分组处理，分别于转染24、48、72h，流式细胞仪检测Ad-hEGF基因转染率（样本数为3），ELISA法检测收集的细胞培养上清液中EGF质量浓度（样本数为6），细胞计数试剂盒8（CCK8）及酶标仪检测细胞增殖活性（样本数为6）。（3）另取细胞分为未转染组和转染组，每组6孔。未转染组用未转染细胞的细胞培养上清液孵育，转染组用以最佳MOI（50）转染Ad-hEGF基因细胞的细胞培养上清液孵育，分别于孵育1、3、5d，CCK8及酶标仪检测细胞分泌的EGF生物活性。（4）另取细胞分为未转染组和转染组，每组12孔。未转染组不转染Ad-hEGF基因，转染组以最佳MOI（50）转染Ad-hEGF基因。转染24h，免疫荧光染色法检测细胞角蛋白14（CK14）、CK19表达。（5）另取细胞，同（4）分组（每组6孔）处理，于划痕后0（即刻）、12、24、48h，倒置相差显微镜下观测细胞迁移距离。对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、LSD检验。结果（1）转染24、48h，各转染组细胞形态与未转染组比较，无明显改变；转染72h，200倍转染组的细胞碎片较未转染组明显增多。转染24、48、72h，未转染组细胞未见绿色荧光蛋白表达，各转染组绿色荧光蛋白阳性细胞数随转染时间延长逐渐增多。（2）各转染组细胞***基因转染率随转染时间延长逐渐增高。转染72h，50～200倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率均大于90％；未转染组及5、20倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率则分别为（0．51±0．20）％、（62．44±6．23）％、（75．00±5．43）％，明显低于50倍转染组的（93．12±2．55）％，P值均小于0．01。随着转染时间的延长，各转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度逐渐增高；转染72h，50倍转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度明显高于其余各组（P值均小于0．01）。转染24、48h，各组细胞增殖活性相近（P值均大于0．05）；转染72h，200倍转染组细胞增殖活性明显低于其余各组（P值均小于0．05）。（3）孵育1d，2组细胞分泌的EGF生物活性相近（P〉0．05）；孵育3、5d，转染组细胞分泌的EGF生物活性明显高于未转染组（P值均小于0．01）。（4）转染24h，转染组细胞CK14、CK19表达较未转染组增强。（5）划痕后0h，2组细胞划痕宽度基本一致。划痕后12～48h，转染组细胞迁移距离明显长于未转染组（P值均小于0．01）。结论Ad-hEGF基因转染人表皮细胞的合适MOI为50～150，以50为最佳，以此MOI转染既能高效表达目的基因，又可保持细胞良好的增殖、分化和迁移能力。

摘要：目的 评价人转化生长因子β1（human transform growth factor-β1，hTGF-β1）基因转染犬自体牙龈成纤维细胞（gingival fibroblast，GF）在治疗人工Ⅱ度根分叉骨缺损中作为组织工程种子细胞所发挥的作用。方法将hTGF．B1基因转染后的犬自体GF作为组织工程种子细胞，与海螵蛸骨天然纳米羟基磷灰石（cuttlebone—transformed nanometer hydroxyapatite，CBHA）体外复合，制备犬下颌前磨牙区的Ⅱ度根分叉人工骨缺损模型，应用随机化完全区组设计方法将36颗犬前磨牙分为以下4组：①阴性对照组：不作任何处理直接缝合；②阳性对照组：置入牙周韧带细胞（periodontal ligament cell，PDLC）．CBHA复合物；③转染GF组：置入hTGF—β1基因转染犬GF—CBHA复合物；④未转染GF组：置入犬GF—CBHA复合物。每组9颗牙。对各组进行组织学观察和测量，并作示踪实验。结果与阴性对照组比较，转染GF组、阳性对照组均可显著促进根分叉区牙周组织的再生（P〈0．01），丽组的新生牙骨质高度（NC）、新生牙槽骨高度（NB）及新生结缔组织高度（NCT）分别为：（2．97±0．50）、（4．29±0．26）及（4．73±0．06）mm；（3．09±0．26）、（4．46±0．25）及（4．69±0．10）mm，且两组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。未转染GF组虽可促进牙槽骨再生[NB=（3．46±0．32）mm]，但牙根有一定程度的吸收；示踪实验显示：转染后的GF在新生牙槽骨及牙周膜组织中均可发现。结论hTGF—β1基因转染后的犬自体GF作为组织工程种子细胞，与CBHA体外复合后在人工Ⅱ度根分叉骨缺损的治疗中有显著的促牙周组织再生的作用，参与了新生牙槽骨及牙周膜的形成。

摘要：背景:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)能与存在内皮细胞表面的特异性受体结合,刺激体内新生血管形成,但在体内半衰期极短,在移植局部难以维持足够的浓度,限制了其临床应用。目的:观察VEGF与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent,EGFP)共表达载体转染对大鼠血管内皮细胞形成新生血管的影响。设计、时间及地点:随机分组设计、对照动物实验,于2004-09/2005-01在中国医科大学附属第一医院器官移植实验室完成。材料:30只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只。质粒pIRES2-EGFP/VEGF165由第四军医大学提供。方法:采用层析法大量提取pIRES2-EGFP/VEGF165质粒,采用阳性脂质体法进行转染,计数1×106血管内皮细胞植入雄性Wistar大鼠肾被膜下。实验组:植入转染质粒pIRES2-EGFP/VEGF165的内皮细胞;空白转染组:植入转染质粒pIRES2-EGFP的内皮细胞;对照组:植入正常大鼠血管内皮细胞。主要观察指标:①转染72h后观察EGFP及VEGF表达情况。②流式细胞仪检测转染效率。③植入后14d苏木精-伊红染色观察植入血管内皮细胞处组织形态学变化。结果:30只大鼠均进入结果分析。①荧光显微镜下实验组内皮细胞有特异性的EGFP表达。②流式细胞仪分析转染效率为13.06%。③实验组血管内皮细胞胞核和胞浆中均有VEGF表达。反转录-聚合酶链反应显示实验组大鼠血管内皮细胞中有人源化VEGF165基因在mRNA水平表达。④移植后14d,实验组大鼠肾被膜下可见成团的新生毛细血管网形成,而对照组及空白转染组虽血管内皮细胞仍存活,但未形成明显血窦。结论:转染VEGF基因是促进内皮细胞早期(14d内)形成新生血管的有效途径。

摘要：背景:基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点:以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料:质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法:首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果:Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论:对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。