摘要：背景:透明质酸关节腔注射治疗骨关节炎已经成为一种常规方法,但对大骨节病的治疗还正在推广,施加透明质酸后对大骨节病患者软骨细胞代谢的影响,目前尚为空白。目的:课题创新性设计观察透明质酸对体外培养的大骨节病软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的影响,以期能指导临床治疗。设计、时间及地点:对比观察,实验于2006-09/2009-01在西安交通大学医学院生物医学研究实验中心和地方病实验室完成。材料:大骨节关节病标本来源于6例大骨节关节病患者实施膝关节手术摘除的软骨及游离体,正常标本来自6例意外截肢或身亡的新鲜膝关节软骨。方法:分离、体外培养两组关节软骨细胞。两组细胞分别给予100,500mg/L不同剂量的透明质酸钠干预及阴性对照(未加干预),培养6d。主要观察指标:通过反转录-聚合酶链反应观察透明质酸对大骨节病和正常人软骨细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达的影响。结果:大骨节病组软骨细胞ColⅡ和aggrecan mRNA表达量均较正常对照降低(P<0.05),采用透明质酸钠补充治疗后,透明质酸钠100mg/L和500mg/L对大骨节病和正常人软骨细胞ColⅡ和aggrecan mRNA的表达均有促进作用,其中透明质酸钠500mg/L的促进作用更显著些。结论:补充透明质酸钠可以促进大骨节病软骨细胞ColⅡ和aggrecan的合成,其中,透明质酸钠500mg/L对大骨节病软骨细胞合成代谢的促进作用较透明质酸钠100mg/L明显。

摘要：背景:在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床。目的:假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子。设计、时间及地点:随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成。材料:健康1月龄新西兰大白兔2只;结缔组织生长因子为Propetech公司产品。方法:获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150μg/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养。主要观察指标:采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况。结果:①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节。②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P<0.01)。不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100μg/L为最佳作用质量浓度(P<0.01)。③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性。结论:结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型。结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化起促进作用的除转化生长因子、成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子基因在软骨细胞中高表达外,软骨调节素Ⅰ和结缔组织生长因子在软骨细胞中的高表达可能在软骨形成过程中发挥重要作用。目的:以Westernblot检测软骨调节素Ⅰ和结缔组织生长因子在大鼠骨髓间充质干细胞、透明软骨细胞及弹性软骨细胞中的差异表达。设计、时间及地点:以细胞为对象的对比观察性实验,于2007-10/2008-04在大连医科大学附属第一医院中心实验室,大连医科大学生物实验室完成。材料:2月龄SD大鼠,雌雄不限。方法:以密度梯度离心法和贴壁培养法提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,酶消化法提取肋软骨透明软骨细胞和耳廓弹性软骨细胞,分别培养二三代后提取细胞总蛋白,Westernblot检测骨髓间充质干细胞、透明软骨细胞及弹性软骨细胞中软骨调节素Ⅰ和结缔组织生长因子蛋白水平表达,并进行定量分析。主要观察指标:软骨调节素Ⅰ和结缔组织生长因子蛋白水平。结果:透明软骨细胞、弹性软骨细胞中软骨调节素Ⅰ蛋白表达明显高于骨髓间充质干细胞(P0.05)。透明软骨细胞、弹性软骨细胞中结缔组织生长因子蛋白的表达明显低于骨髓间充质干细胞(P0.05)。结论:透明软骨细胞和弹性软骨细胞中高表达软骨调节素Ⅰ蛋白,骨髓间充质干细胞高表达结缔组织生长因子蛋白,说明软骨调节素Ⅰ可能在成熟的软骨细胞中发挥着重要作用,提示其可作为定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的重要备选生物因子。

摘要：背景:研究表明,地塞米松可以使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少,Ⅰ型胶原增多,但糖皮质激素对关节软骨细胞增殖作用的机制尚不十分清楚。目的:验证地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞增殖的影响。设计:对比观察。材料:1月龄新西兰白兔用于软骨细胞的分离与培养。方法:兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同质量浓度地塞米松磷酸钠(0.02,0.1,0.5g/L)的DMEM培养液。主要观察指标:①原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察。②应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原能力。③透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。结果:实验组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢。各实验组Ⅱ型胶原平均灰度值均显著高于对照组(P<0.05)。实验组软骨细胞进入S期、G2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0/G1期的细胞比率增加。电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。结论:地塞米松磷酸钠抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白的合成能力有关。

摘要：背景:组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望,最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞是修复全层软骨缺损的最佳细胞源。目的:在体外团状培养系统中,以Ad-hTGF-β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定。设计、时间及地点:以细胞为对象的重复观察测量实验,于2007-06/2008-01在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。材料:2月龄日本大耳白兔由解放军第三军医大学实验动物中心提供。方法:兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后,在团状培养系统中培养。通过组织学、免疫组化及反转录-聚合酶链反应方法检测其成软骨分化。主要观察指标:组织学染色观察细胞形态改变,免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。结果:组织学染色显示,诱导后细胞呈软骨细胞样形态。免疫组化方法及反转录-聚合酶链反应结果显示,诱导后的细胞表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原。结论:骨髓间充质干细胞经Ad-hTGF-β1诱导后在团状培养系统中可分化为软骨细胞。

摘要：背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实。目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性。设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成。材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间充质干细胞。方法:取第2代脂肪间充质干细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周。对照组单纯加入基础培养液。主要观察指标:两种诱导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达。结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精-伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,II型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到II型胶原和Aggrecan mRNA的表达。单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现II型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达。结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质。简单的单层培养方式诱导失败。

摘要：目的:探讨A型激酶锚定蛋白2(A-kinase anchoring protein 2,AKAP2)基因表达对生长板软骨细胞(growth plate chondrocytes,GPCs)增殖、分化及细胞外基质代谢的影响及作用机制。方法:设计AKAP2过表达和基因敲除质粒转染GPCs对AKAP2进行过表达或干扰,构建AKAP2过表达阴性对照组(Vector组)、AKAP2过表达组(AKAP2 OE组)、AKAP2干扰阴性对照组(si-NC组)、AKAP2干扰组(si-AKAP2组)和AKAP2 OE+U0126组[U0126:细胞外信号调节蛋白激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)通路阻滞剂],记录各组GPCs细胞增殖活力及钙盐沉积情况,检测细胞外基质中Ⅱ型胶原α1(collagen typeⅡalpha 1,COL2A1)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ,COLⅡ)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和性别决定区Y框蛋白9(SRY-related high-mobility group box gene 9,SOX9)以及ERK1/2表达和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)磷酸化水平,并进行统计学分析。结果 :与Vector组相比,AKAP2 OE组细胞内AKAP2、ALP、COL2A1基因表达与AKAP2、PCNA、SOX9、ALP、COLⅡ蛋白表达及48h细胞活力、p-ERK1/2磷酸化水平均升高,橘红色钙结节显著增多,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:AKAP2基因可以通过调控ERK1/2信号通路影响软骨细胞增殖、分化和细胞外基质代谢,并可能进一步改变正常的生长板软骨内成骨模式。

摘要：背景:小干涉核糖核酸是核糖核酸干涉的起始诱导物,在细胞内引起强烈的核糖核酸干涉,降解目的基因的信使核糖核酸,以控制目的基因表达。目的:利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制软骨细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及其基质金属蛋白酶9的表达,观察在软骨细胞中核因子κBp65与细胞因子的关系。设计、时间和地点:单一样本观察,细胞学体外实验,于2006-09/2007-09在北京大学医学部中心实验室完成。材料:SD大鼠关节软骨细胞。方法:利用质脂体将筛选优化好的核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸转染软骨细胞,特异性抑制核因子κBp65的表达,继而抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及基质金属蛋白酶9的表达。主要观察指标:利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性,反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法分析从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测基质金属蛋白酶9的表达。结果:核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达,降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的转录活性,抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶9的表达。结论:在软骨细胞中核因子κBp65与肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β关系密切。

摘要：背景:骨髓基质细胞持续稳定地向软骨细胞转化一过程中,物理、化学和生物等诸多因素均发挥着作用,某些因素的共同作用会更有利于细胞的转化,而转化生长因子β1和胰岛素样生长因子等均可诱导骨髓基质细胞向软骨细胞分化。目的:拟验证转化生长因子β1与胰岛素样生长因子在体外联合诱导犬骨髓基质细胞向软骨细胞分化的效果。设计、时间及地点:细胞观察,于2006-05/10在中山大学附属第三医院中心实验室完成。材料:清洁级12月龄雄性成年杂种犬1只,用于分离培养骨髓基质细胞。转化生长因子β1、胰岛素样生长因子I由美国Sigma公司生产。方法:自犬髂后嵴处抽取骨髓10mL,密度梯度法分离培养骨髓基质细胞,传至第3代,调整细胞密度为2×109L-1。诱导组向细胞内加入含10μg/L转化生长因子β1、50μg/L胰岛素样生长因子I、50mg/L维生素C、10-7mol/L地塞米松、1%ITS-A、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基。对照组仅加入含10%胎牛血清的高糖DMEM进行常规培养。主要观察指标:诱导后细胞形态学变化。诱导后组织化学及免疫组化检测结果。结果:与对照组比较,第3代骨髓基质细胞成软骨诱导48h后能明显促进细胞集落生长,细胞增殖加快,但细胞形态无变化,仍为长梭形;诱导14d后大部分细胞呈多角形或圆形,折光性增强。诱导后番红O染色、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色均呈阳性表达。结论:转化生长因子β1与胰岛素样生长因子I体外联合诱导可获得骨髓基质细胞源性软骨细胞。

摘要：背景:有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。目的:验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。设计、时间及地点:随机对照细胞实验,于2007-09/2008-07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。材料:清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1.5～2.0kg。方法:分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。主要观察指标:倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。结果:脂肪干细胞分别经油红O染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。结论:与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。