摘要：背景:目前关节软骨的损伤修复研究倾向于构建组织工程骨与软骨复合物,旨在修复软骨下骨缺损的同时,使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面,从而加快界面的愈合。目的:以三维多孔聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly(lactide-co-glyco-lide),PLGA)、Pluronic-F127水凝胶分别作为骨和软骨支架材料,验证两者作为组织工程支架联合应用于构建组织工程骨软骨组织的可行性。设计、时间及地点:开放性实验,2006-07/2007-04于中山大学附属第二医院医学研究中心完成细胞培养,于中山大学北校区实验动物中心完成动物实验。材料:将培养的新西兰大白兔关节软骨细胞和胫骨骨膜的成骨细胞分别与Pluronic-F127凝胶及PLGA混合形成复合物后,在骨细胞复合物的表面涂布负载软骨细胞的PluronicF-127水凝胶制备组织工程骨软骨复合物。方法:裸鼠20只切开背部皮肤及皮下组织,切口左侧植入组织工程骨软骨复合物1枚,切口右侧植入单纯PLGA支架和单纯Pluronic-F127凝胶各1枚为对照。主要观察指标:植入后2个月取材,进行大体形态学及组织学观察骨组织及软骨组织形成情况,II型胶原免疫组化观察软骨细胞Ⅱ型胶原表达能力。结果:术后2个月形成有弹性骨软骨复合物,在暗红色的部分,新形成的骨组织连接成片块状或条索状,PLGA已完全降解,在白色的部位,已形成较成熟的软骨组织,形态基本正常,分布较均匀,Pluronic-F127已完全吸收;软骨组织与骨组织的交界面处二者结合良好,部分区域可见软骨部分嵌入于骨组织中。实验组软骨组织II型胶原免疫组化染色呈阳性。结论:Pluronic-F127和PLGA作为骨和软骨支架材料,可以形成具有良好界面结合的骨软骨组织。

摘要：背景:目前所用的生物因子诱导骨髓间充质干细胞后尚未获得成熟的软骨细胞,以骨髓间充质干细胞为种子细胞的软骨组织工程也未得到有临床应用价值的组织工程化软骨,所得到的被证明只是软骨样组织。目的:应用基因芯片技术筛选大鼠骨髓间充质干细胞及软骨细胞的差异表达基因。设计、时间及地点:细胞学基因水平实验,于2007-07在大连医科大学附属第一医院中心实验室完成。材料:健康2月龄SD大鼠8只,由大连医科大学实验动物中心提供。27K Rat Genome Array芯片由北京博奥基因芯片公司提供。方法:无菌条件下体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳部软骨细胞,采用Trizol一步法提取两种细胞的总mRNA并纯化,反转录为双链cDNA探针,用Cy5-dCTP,Cy3-dCTP分别标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞,杂交并清洗,应用双通道激光扫描仪进行扫描,所得荧光信号图像用GenePixPro4.0图像软件进行分析。主要观察指标:基因表达谱芯片杂交结果。结果:按差异显著性标准(差异为2倍),以骨髓间充质干细胞为对照,在软骨细胞中有1226条基因上调,888条基因下调。由于骨髓间充质干细胞和软骨细胞的差异表达基因数量较多,所以将Cy5/Cy320的基因定义为显著差异基因,结果发现两种比较重要的细胞因子:软骨调节素、结缔组织生长因子。结论:基因芯片技术可作为组织工程软骨研究中筛选细胞因子的有效手段。软骨调节素与结缔组织生长因子在软骨细胞中高表达,提示二者与骨髓间充质干细胞向软骨的分化关系密切。

摘要：背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<001)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。

摘要：背景:从骨关节炎关节软骨中分离培养软骨细胞,再用免疫磁珠分选技术从关节软骨中分选软骨祖细胞,并进行鉴定,经作者检索目前国内没有报道。目的:实验选取人工膝关节置换患者软骨组织体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,拟进一步验证在人软骨组织中含有间充质祖细胞。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-06/12在解放军第三军医大学毒理教研室及西南医院烧伤科实验室完成。材料:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(>3cm),患者对治疗及实验均知情同意。方法:统一选用原发性骨关节炎患者关节软骨标本,采用免疫磁珠法分选获得CD105/CD166阳性细胞。并进行成软骨和成脂诱导分化。主要观察指标:①免疫磁珠分选细胞用流式细胞仪和免疫组织化学检测,观察细胞生长特性。②分选细胞成骨和成脂分化后细胞形态和功能的变化。结果:①免疫磁珠分选的关节软骨间充质祖细胞原代和传代细胞均具有干细胞的生长特性。②分选的细胞免疫组织化学检测表达CD105和CD166阳性染色,流式细胞仪检测CD105和CD166阳性细胞比例分别为98.72%和97.5%。④分选细胞经成软骨、成脂诱导后能分化为具有相应细胞表型的细胞。结论:人关节软骨组织中存在具有干细胞特性的软骨间充质祖细胞,利用免疫磁珠技术可成功地将其从关节软骨细胞中分离出来。

摘要：目的设计并实现一种针对核磁共振成像(MRI)图像的关节软骨自动分割算法。方法利用像素的整体与局部特征分别构建二分类支持向量机(support vector machine,SVM)分类器对股软骨、胫软骨及髌软骨进行自动分割。首先提出一种基于边缘数目反馈的Canny检测器阈值迭代法并利用该方法提取图像的主要边缘,随后根据特征参数对提取的边缘进行识别并标记出不同的骨-软骨边缘,利用训练的SVM分类器对软骨进行初步分割并根据软骨的解剖位置缩小搜索空间,最后利用形态学操作对初步分割结果进行优化。结果自动分割结果中软骨的形态轮廓与原始图像吻合效果好,股软骨、胫软骨及髌软骨的Dice’s系数平均值分别为0.80、0.76、0.74,与手工分割结果具有较好的一致性。结论该算法能够准确、快速地分割出MRI图像中不同的软骨组织。

摘要：背景:软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料,保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础。目的:对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察。设计:细胞形态对比,观察12周实验结果。单位:郑州大学骨科研究所,上海第二医科大学骨科实验室。对象:实验于2001-09/2002-06在上海第二医科大学骨科实验室完成。3月龄雄性新西兰大白兔9只,平均体质量3.2kg。方法:复合材料分别为:①藻酸钙。②藻酸钙+骨髓基质细胞。③藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子I。④藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β。⑤藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子I。将5种组合注射于同一个体新西兰大白兔背部不同部位皮下组织中,每组各注射2处,共10处,每处0.2mL,分别做好标记。按组分别于术后4,8,12周取材,各时间点处死动物3只,取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察,应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术。主要观察指标:兔背部皮下增殖物的组织学观察。结果:兔背部皮下增殖物的组织学观察结果:4周时可见藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子I、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子I组有岛状软骨样组织形成,软骨细胞包绕于碱性基质中,8周时复合物中形成大量的类软骨结构,并部分向骨组织转化,细胞周围有大量的基质分泌,部分软骨细胞呈簇状分布。12周时藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子I组软骨组织基本转变为骨组织,并开始吸收。结论:骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织。藻酸钙适合骨髓基质细胞生长,是一种良好的骨及软骨组织工程载体。

摘要：背景:在组织工程骺软骨构建过程中,采用何种载体承载已经扩增了的软骨细胞越来越受到人们的关注。目的:探讨软骨细胞外基质与壳聚糖复合构建组织工程骺软骨支架的可行性并对其性能进行初步观察。设计、时间及地点:体外观察实验,于2007-12/2009-03在解放军总医院骨科研究所完成。材料:壳聚糖(脱乙酰度90%,Mr10×105)由青岛海汇生物工程公司提供。市售猪关节软骨。方法:将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎,梯度离心后制备成3%软骨微丝悬液,将其按1︰1的比例与2%的壳聚糖溶液混合,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。主要观察指标:对梯度乙醇处理再次干燥后支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性。分离培养兔骨髓间充质干细胞,用转化生长因子β1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况。结果:支架内孔洞相互连通,孔大小(161±31)μm,孔隙率为(90.1±1.6)%,吸水率为(2361±132)%。组织学观察显示,三维多孔支架甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。MTT法结果显示支架无细胞毒性。细胞在支架表面黏附良好,分布均匀,并有基质分泌。结论:制备的软骨细胞外基质和壳聚糖复合三维多孔支架结合良好,含有软骨细胞外基质主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好。

摘要：目的以丝素蛋白（silk fibroin，SF）和羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）为材料制备含软骨钙化层（calcified cartilage layer，CCL）的仿生骨软骨支架，接种兔脂肪干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs），评估CCL在体内修复中起到的作用，探讨这一设计组合作为骨软骨组织工程理念的可行性。方法以SF／HA为材料，采用石蜡微球沥滤和定向结晶（thermally induced phase separption, TIPS）结合技术，制备含软骨钙化层的多相一体化仿生支架，通过扫描电镜、micro—CT进行观察，测定支架软骨层和成骨层的孔径、孔隙率和压缩弹性模量；ADSCs接种到支架上，建立兔双侧膝关节骨软骨缺损模型，分别植入CCL支架组、***＋ADSCs组（不含CCL的支架复合自体ADSCs）和CCL＋ADSCs组（含CCL的支架复合自体ADSCs），分别在术后4、8、12周取材，进行大体观察评分、组织学和免疫组化评估、新生骨组织***扫描，评估各组兔膝关节骨软骨缺损修复效果，对比分析CCL在体内修复中起到的作用。结果含CCL的仿生骨软骨支架由层次鲜明的“透明软骨-CCL-软骨下骨”组成，各层连接紧密。软骨层具有明显的取向微孔结构，分布均匀，孔径（112．43±12．65）μm，孔隙率为90．25％±2．05％；软骨下骨层具有良好的三维大孔结构，连通性好，孔径（362．23±26．52）μm，成骨层孔隙率为85．30％±1．80％；CCL＋ADSCs组软骨再生情况优于non-CCL＋ADSCs组，组织学和免疫组化染色可见GAG和Ⅱ型胶原表达较non-CCL＋ADSCs组高；新生骨组织分析、生物力学性能测试在两组间未见明显差异。结论含CCL的SF／HA仿生骨软骨支架模仿正常骨软骨组织结构，具有良好的三维孔隙结构和生物相容性。该支架复合自体来源的ADSCs成功修复兔膝关节骨软骨缺损，CCL的存在加速软骨组织的生长。

摘要：作者就影响游离骨膜移植修复关节软骨缺损的五个因素分十二水平，使用生长期家兔，正交设计安排实验。术后４周处死取材，进行多指标观察，方差分析。结果表明下列因素均影响游离骨膜修复关节软骨缺损，即创面面积以小于２者为好；生发层朝向关节腔优于朝向创面者；骨膜旋转９０°更有利于关节面的修复；骨膜与创面面积比值应为１．３～１．６：１；合适的ＣＰＭ可以促进移植物早期构型，诱导移植物向类透明软骨转化。

摘要：背景:选择适合的生物支架与骨髓间充质干细胞作为新型的种子细胞复合能否构建出理想的组织工程化软骨?目的:观察将扩增的兔骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸构建人工软骨的可行性。设计:单一样本观察。单位:泸州医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科。材料:实验于2004-10/2005-10在泸州医学院完成。选用8只日本大耳兔,雌雄不拘,清洁级,二三个月龄,体质量1.5～2.0kg,常温常湿环境饲养。聚羟基乙酸由美国Albany公司生产。方法:分离、获取、扩增实验兔骨髓间充质干细胞,将聚羟基乙酸剪成1cm×1cm×1cm大小,并以多聚赖氨酸包被,通过将扩增的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸上,按4mL/cm3多点播散的方式均匀地接种在预湿的聚羟基乙酸支架上,体外诱导培养3周,作为实验组。将不加入骨髓间充质干细胞的聚羟基乙酸支架作为对照组。将实验组和对照组的标本分别植入4只自体兔腹腔内,进行体内培养6～12周后,分别取出实验组与对照组的标本,对其进行大体观察。同时以100g/L中性甲醛固定,行5μm切片,采用苏木精-伊红染色观察标本的组织形态学特点,进行阿新蓝染色以观察酸性粘多糖形成,进行甲苯胺蓝染色以观察异染性基质的形成,进行免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白的表达。主要观察指标:两组支架植入实验兔体内后6,12周时标本大体观察结果、不同染色观察结果及Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果:纳入8只实验兔均进入结果分析。①支架植入实验兔体内后6及12周标本大体观察结果:支架植入兔腹腔6周后,实验组标本均仍被腹腔大网膜包裹,剥去大网膜后,有3个标本成淡黄色,光滑,质地中,外形与植入前基本一致,1个标本呈灰黑色,质地很软,标本不能成形。12周后,实验组标本的外形仍与植入前基本一致,呈灰白色,光滑,但质地明显较硬。而第6,12周的对照组的标本大部分均被吸收,以第12周的标本更明显,且均未见软骨样组织形成。②支架植入实验兔体内后6及12周不同染色观察结果及Ⅱ型胶原蛋白的表达:苏木精-伊红染色结果显示:6周时,有软骨陷窝样结构开始形成,聚羟基乙酸支架开始降解;12周时,复合物呈现软骨组织样的形态,有较明显的软骨陷窝样结构形成,细胞排列规则,成群存在于软骨陷窝样结构内,边缘的细胞小,中央的细胞大,聚羟基乙酸基本完全消失。阿新蓝染色结果:6周时,组织内有部分区域被染成淡蓝色;12周时组织的基质被广泛染成蓝紫色,说明有大量的酸性粘多糖形成。苯胺蓝染色结果:6周时,组织内可见蓝色异染性基质;12周时组织内呈现很强的蓝色异染。免疫组织化学染色结果:6周时,胞浆内可见棕黄色阳性颗粒,基质内有少量的Ⅱ型胶原蛋白表达;12周时,胞浆、基质内均有较强的阳性表达。Ⅱ型胶原蛋白的表达:6周时,胞浆内可见深棕黄色阳性颗粒,基质内有少量的Ⅱ型胶原mRNA表达;12周时,胞浆、基质内均有强的阳性表达。对照组标本基本上已被吸收,没有成形的组织工程化标本。结论:兔骨髓间充质干细胞在诱导剂作用下,经体外和体内培养后,可生成组织工程化类软骨。