摘要：从辣根侧根中提取总RNA,以OligodT(18)为引物,通过反转录获得了辣根总mRNA的cDNA。以获得的cDNA为模板,利用设计的一对特异寡核苷酸引物P1和P2进行PCR扩增,得到了辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7)同功酶C2的结构基因(hrpC2)。将hrpC2与真核表达质粒载体pPICZα-A分别用限制性内切酶EcoRI和Xbal双酶切后连接,构建了重组质粒表达载体pPICZα-A-hrpC2。将pPICZα-A-hrpC2转化大肠杆菌筛选阳性克隆并测序。测序结果显示,pPICZα-A-hrpC2重组质粒构建成功。利用BlastN程序进行DNA序列分析,显示该序列为目的ORF框,无移码突变;与Fujiyama.K,Takemura.H等报道的hrpC2序列[D90115.1]有95%的同源性。

摘要：该文建立了一种可视化的、基于氧化还原反应界面移动距离定量检测辣根过氧化物酶(HRP)的方法。比较了隐色结晶紫显色体系和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色体系对HRP的显色效率,并构建了基于3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色体系的氧化还原反应电泳滴定模型。同时,文中还设计了适用于该模型的小型化、便携式滴定检测芯片,并对滴定通道凝胶中组分进行了优化。结果表明,界面移动距离与HRP浓度存在对数线性关系,检测灵敏度可达0.002 mg/L,且可在10 min内完成HRP的裸眼检测。该方法不需要配备信号读取装置,用户只需要读取有色界面移动的距离即可实现对待测物的可视化定量检测,对于即时检测具有潜在的应用价值。

摘要：本文设计一种芯片三电极系统,以金盘电极为工作电极,金片电极为辅助电极,Ag/AgCl电极为参比电极,以邻联茴香胺(ODA)和邻苯二胺(OPD)两种常见的底物体系建立了检测辣根过氧化物酶(HRP)的方法。HRP能够催化H_(2)O_(2)氧化ODA和OPD,其氧化产物在芯片金电极上分别于-0.23 V和-0.50 V(***/AgCl)处产生一个灵敏的还原峰,峰电流随HRP浓度增加而增大。对于ODA-H_(2)O_(2)体系,测定游离HRP的范围是5.0×10^(-7)~1.0×10^(-5)g/mL,检出限为1.0×10^(-7)g/mL(3σ)。对于OPD-H_(2)O_(2)体系,测定游离HRP的线性范围是1.0×10^(-8)~1.0×10^(-4)g/mL,检出限为1.0×10^(-9)g/mL(3σ)。

摘要：研究了一种在聚硫堇修饰玻碳电极上利用电位控制组装辣根过氧化物酶（HRP）的新方法.首先将硫堇（TH）电聚合到玻碳电极（GCE）表面,形成均匀的带正电荷的导电聚合膜,再通过调节溶液的酸度使HRP带负电荷,利用电位控制的方法在硫堇聚合膜（PTH）上组装HRP,通过循环伏安法和电化学交流阻抗法对HRP的整个组装过程进行表征.在优化的实验条件下,采用计时电流法将HRP修饰电极用于H2O2检测,结果表明,在2×10^-5～2×10^-2mol·L^-1范围内HRP修饰电极的响应电流与H2O2浓度呈良好的线性关系,该研究对各类酶传感器、免疫传感器的设计与制备具有重要意义.

摘要：设计了一种发卡型核酸探针,结合脱氧核酶(DNAzyme)与支点介导链置换技术建立了一种检测端粒酶的新方法.该发卡型探针通过阻碍G-四链体的形成来抑制DNAzyme的过氧化物酶活性.当体系中的端粒酶引物TS被催化延伸后,可以通过链置换反应破坏该发卡结构,从而释放出自由的DNAzyme以催化过氧化氢氧化ABTS2-,产生可被检测的吸收信号变化.实验结果表明,应用该方法可以检测低至500个Hela细胞等当量的端粒酶,且该方法操作简单、不需要荧光标记和复杂的表面修饰,有望在肿瘤细胞端粒酶活性分析中获得广泛应用.

摘要：利用水热法和直接沉淀法,设计合成了5例由过渡金属(TM)-联咪唑配阳离子与Dawson型钨磷酸阴离子构成的多金属氧酸盐(POM)基有机-无机杂化化合物[Ni(H_(2)biim)_(3)]_(4)[Ni(H_(2)biim)_(2)(P_(2)W_(18)O_(62))_(2)]·2H_(2)O(1),[Co^(Ⅲ)(H_(2)biim)_(3)]_(2)[P_(2)W_(18)O_(62)]·8H_(2)O(2),[Cu(H_(2)biim)_(2)]_(3)[P_(2)W_(18)O_(62)]·4H_(2)O(3),[Co^(Ⅱ)(H_(2)biim)_(3)]_(2)H_(2)[P_(2)W_(18)O_(62)]·9H_(2)O(4)和[Ni(H_(2)biim)_(3)]_(3)[P_(2)W_(18)O_(62)]·2H_(2)O(5);并利用X射线单晶衍射分析(SC-XRD)、红外光谱(IR)和热重-差热分析(TG-DTA)等对其进行了表征.化合物1~5作为载体用于固定辣根过氧化物酶(HRP)时,显示出了较高的酶固定化能力.另外,利用圆二色光谱(CD)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等方法评价了固定化酶HRP/1~HRP/5的重复使用性、储存稳定性和检测过氧化氢(H_(2)O_(2))的性能.由于该类POMs与HRP间存在强的相互作用,利用简单的物理吸附法即可实现POMs对HRP的固载.POMs对酶的固定不但提高了HRP对使用及储存环境的耐受性,同时也拓展了POMs在酶固定化领域的应用.

摘要：针对生物酶在固相载体负载后存在的催化活性与稳定性之间"此消彼长"的问题,本工作采用"自牺牲模板"策略以铝基金属有机骨架材料(Al-MOF)为前驱体设计制备多级孔Al_(2)O_(3)(MHAl_(2)O_(3))材料,再以"聚多巴胺(PDA)"仿生膜对材料表面进行功能化修饰后用以固载辣根过氧化物酶(HRP).通过调节前驱体的煅烧温度来实现载体孔径大小的调控,探讨了载体的孔道限域效应对固定化酶反应器催化活性的影响,所得固定化酶反应器的热稳定性和重复使用性显著提高.为了解析固定化酶反应器的构效关系,采用酶动力学和热动力学参数研究了固定化酶反应器催化过程中酶与底物的相互作用,结果表明固载后酶分子对底物的亲和性和专一性得到提升.将固定化酶反应器用于模拟废水中苯胺黑药的催化降解时,表现出非常高效的催化效率.

摘要：微米尺度下的生物流体混合是生物微机电系统(BioMEMS)和分析化学等领域研究的重要问题之一,目前的混合方式多以被动式自由扩散为主,存在流体混合效率不高的现象.针对该问题,设计了一种主动式聚二甲基硅氧烷(PDMS)微混合器.该装置利用脉冲气体对多个PDMS微隔膜进行顺序驱动,可实现微混合室中不同液体的快速混合和反应.同时,基于鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光反应机理,以辣根过氧化物酶(HRP)作为催化剂,进行了微混合器最佳工作条件研究,基于HRP化学发光分析法和L25-5-6正交实验,确定出微混合器化学发光分析法的最优实验条件组合,并在此实验条件下完成了HRP的微量测定.实验结果表明,目前检测体系下线性范围为2.05×10-9 mol/L～2.05×10-8 mol/L,检测限为2.05×10-9 mol/L,检测反应时间小于2 min,可满足生物医学和分析化学领域对于物质测定方面的微量、快速的检测要求.

摘要：传统的酶联免疫分析包括两次分子杂交,在临床检测等实际应用过程中耗时较长,增加了操作人员的劳动强度。通过基因工程构建一抗(单克隆抗体)和标记酶如辣根过氧化物酶(HRP)的融合蛋白,变两次分子杂交为一次分子杂交,即可大大缩短酶联免疫分析的时长。本研究以人胰岛素单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)基因为模板,依据酵母密码子偏好性进行密码子优化、稀有密码子剔除、转录终止子类似结构消除等设计,合成了编码scFv-HRP重组融合蛋白的基因。该基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pET28a与酵母遗传转化载体pGAPZαA。pET-scFv-HRP在*** BL21(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),其产率可达总蛋白的4.6%;在*** Rosette(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),未出现可见的诱导表达蛋白带。pGAP-scFv-HRP线性化后转化*** GS115,获得了12个阳性菌落。其中3株(4号,7号和8号)含有较高重组基因拷贝(依据博来霉素测试)。4号转基因酵母菌株摇瓶发酵后,对发酵液和细胞破碎后的上清液进行SDS-PAGE分析,在scFv-HRP理论分子量(63 kD)条带附近有明显的蛋白质条带出现。以抗纯化标签(6×His)抗体进行免疫印迹检测,该位置蛋白条带显示阳性。切下该位置蛋白条带后进一步进行串联质谱分析,结果表明该位置的蛋白条带含有重组蛋白scFv-HRP的片段且氨基酸残基序列一致。重组人胰岛素单链抗体和辣根过氧化物酶融合蛋白scFv-HRP的构建为后续建立胰岛素快速检测方法提供了重要材料基础。

摘要：利用二元酶系(辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)和葡萄糖,通过一步法或两步法对大豆分离蛋白进行交联处理。以修饰产物中相对二酪氨酸含量为指标,采用单因素实验确定一步法处理大豆分离蛋白的反应的适宜条件为:葡萄糖添加量1.8%、葡萄糖氧化酶添加量4.0U/g蛋白质、辣根过氧化物酶添加量200U/g蛋白质、反应时间3h。在一步法处理的反应条件下,一步法和二步法处理的大豆分离蛋白相对二酪氨酸含量分别为414和381。与大豆分离蛋白相比,交联蛋白分散液的表观黏度和黏弹性均有显著改变,同时其酸凝胶的胶凝时间缩短、胶凝温度降低。