摘要：目的构建Cx43-siRNA真核表达载体,获得连接蛋白43(connexin43,Cx43)被长期稳定抑制的睾丸间质细胞(TM3细胞)系和睾丸支持细胞(TM4细胞)系,为研究Cx43及其形成的细胞缝隙连接(gap junction,GJ)在睾丸组织中的作用提供有用模型。方法设计合成3对针对Cx43的短发夹样siRNA的DNA模板序列,定向连接到siRNA真核表达载体pSilencerTM2.1-U6neo上,通过测序鉴定后以脂质体法瞬时转染睾丸支持细胞,以Western blot方法检测Cx43蛋白表达水平,筛选出最有效的干扰序列,再将之分别转染睾丸间质细胞和睾丸支持细胞,G418筛选出能稳定表达siRNA的细胞系,以"Parachute"荧光传递示踪法检测细胞缝隙连接功能。结果 Western blot结果显示,第3对干扰序列对Cx43表达抑制效果最佳,以表达该序列的质粒稳定转染的TM3细胞和TM4细胞上Cx43蛋白表达水平均明显降低;荧光传递示踪法检测表明,两种细胞系的GJ功能均被明显抑制。结论以Cx43-siRNA真核表达载体稳定转染的方法能长期干扰TM3和TM4细胞上Cx43的表达,并抑制由其形成的GJ功能。

摘要：目的 研究胺碘酮与抗心律失常肽合用抗心律失常的效果.方法 日本长耳兔200只,随机分为假手术组20只（A组）和结扎冠状动脉的心肌梗死（心梗）模型组180只.术后8 周末,再将存活的124只心梗模型兔随机分为对照组31只（B组）、胺碘酮组31只（C组）、抗心律失常肽（AAP10）组31只（D组）、胺碘酮＋AAP10组31只（E组）.第9周开始给A、B及D组兔口饲生理盐水2 ml、1次/d,给C、E组兔口饲含胺碘酮的生理盐水2 ml、1次/d,胺碘酮用量100 mg·kg-1·d-1.12周末,A、B、C、D、E组各存活20、24、26、25、27只.查超声心动图,麻醉后取左室心肌块动脉插管灌流,A、B及C组灌流台氏液,D、E组灌流加入500 nmol/L AAP10的台氏液,程序刺激同时记录容积心电图及QT、QRS、ERP、Tp-e及室性心律失常诱发率,计算Tp-e/QT.灌流完成后取心肌组织,利用Western blot和免疫荧光技术检测缝隙连接蛋白（Cx）43.组间计数资料统计学分析采用bonferroni方法校正的卡方检验或精确检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.组间计量资料统计分析采用完全随机设计资料的方差分析;另B、C、D、E组间计量资料采用析因设计的方差分析,以评价两种药物之间的交互作用,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 A、B、C、D、E组心律失常诱发率分别为0、62.5%、26.9%、40.0%、22.2%,E组较B组诱发率减小.B组较A组Tp-e/QT增大,E组较B组Tp-e/QT减小.B组较A组Cx43表达明显减少.C、E组较B组Cx43表达增加,差异有统计学意义.结论 陈旧性心梗兔离体心肌块模型可用于室性心律失常的研究.胺碘酮慢性应用能上调心梗兔Cx43,与AAP10合用上调心梗兔Cx43作用加强,并进一步减小Tp-e/QT,抗心律失常作用进一步加强.

摘要：目的建立组织工程心肌研究中系统观察免疫组化检测结果的程序与方法。方法取新生大鼠心脏制作石蜡组织切片;用0.25%胰酶消化法分离原代新生大鼠心肌细胞,一部分进行细胞爬片培养,一部分与液态胶原混合构建组织工程心肌并施加力学拉伸刺激,制作组织工程心肌石蜡组织切片。对三者分别进行心肌肌钙蛋白T(cTnT)及细胞间隙连接蛋白43(Cx43)抗体的免疫组化染色。比较观察天然心肌组织、体外培养心肌细胞及组织工程心肌组织免疫组化的检测结果,对其形态结构的变化进行综合分析。分别选取5个不同视野对细胞总数和cTnT阳性细胞进行计数,计算百分比。在细胞和再造心肌组织培养过程中观察自发收缩的细胞区域与cTnT着色区域的关系。结果天然心肌和组织工程心肌切片分别反映了天然在体心肌和体外构建心肌的细胞形态和组织结构特征;心肌细胞爬片显示了体外心肌细胞与非心肌细胞的形态,以及随体外培养时间的延长其形态和数量比例的改变。细胞在体外培养时间越长,成纤维细胞比例越高。尽早将分离的原代新生大鼠心肌细胞与液态胶原混合体外再造心肌组织进行三维拉伸培养有助于抑制其中的成纤维细胞的增殖速度。将分离细胞爬片培养4h后可相继观察到能自发收缩的细胞,其收缩区域与染色片中cTnT的着色区域基本相符;再造的组织工程心肌的收缩自拉伸后48h开始,逐渐从单个细胞到肌束再到整条再造心肌,频率逐渐加快,从1～2/min到5～10/min。结论建立了观察与分析组织工程心肌免疫组化结果的程序和方法,为优化实验设计与条件提供了客观参数,也为构建其他组织的形态学观察与分析方法提供了有利借鉴。

摘要：背景：细胞间缝隙连接由间隙连接蛋白（Cx）构成,在肿瘤侵袭和血管形成过程中起重要作用。目的：以RNA干扰技术下调人胰腺癌细胞Cx43表达,观察Cx43表达改变对胰腺癌细胞缝隙连接的影响,探讨其在胰腺癌细胞侵袭和血管形成中的作用。方法：设计靶向Cx43的小干扰RNA（siRNA）并转染人胰腺癌细胞株BxPC3,以实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测Cx43siRNA的干扰效果。染料传递实验检测细胞间缝隙连接,体外血管形成实验检测与BxPC3细胞共培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管生成能力,体外侵袭实验检测BxPC3细胞的侵袭能力。结果：Cx43siRNA转染BxPC3细胞后,细胞Cx43mRNA和蛋白表达明显下调。Cx43表达下调后,BxPC3细胞间、BxPC3细胞与HUVEC间缝隙连接显著减少;与BxPC3细胞共培养的HUVEC血管生成增多,每视野血管节点数显著高于对照组（15.69±1.09对5.24±1.32,P〈0.05）;BxPC3细胞的侵袭能力亦明显增强,每视野侵袭细胞数显著多于对照组（76.0±3.0对48.0±2.0,P〈0.05）。结论：下调Cx43表达可能通过减少细胞间缝隙连接,促进人胰腺癌细胞的侵袭和血管形成。

摘要：目的 研究间隙连接蛋白connexin43在人成纤维细胞衰老过程中的调节作用。方法 设计并合成针对人connexin43的双链RNA（siRNA），抑制人二倍体成纤维细胞WI-38细胞的connexin43表达和细胞间通讯功能，观察对其衰老相关β-半乳糖苷酶（SA—β-gad染色阳性率、细胞增殖能力、细胞周期调节蛋白P27、P21表达水平等衰老表型的影响。结果 我们合成的siRNA—cx43可高效、特异的抑制connexin43 mRNA和蛋白质表达及细胞间通讯功能。转染WI-38细胞后，细胞增殖能力降低、细胞SA—β-gal染色阳性率（75．32±5．17）较对照组（32．48±3．94）和转染siRNA—con组（37．81±4．12）细胞升高（P〈0．05），P27、P21表达增加，转染siRNA—cx43的WI-38细胞增殖能力显著降低，细胞变扁平、肥大，细胞SA—β-gal染色阳性率达100％，细胞提前出现衰老。结论 间隙连接蛋白connexin43对WI-38细胞的衰老进程有重要的调节作用，其表达减少和细胞间通讯功能降低，可以促进WI-38细胞衰老进程。

摘要：目的研究U50,488H(选择性κ阿片受体激动剂)是否通过抑制钙通道减少外钙内流参与了κ阿片受体的抗缺血性心律失常作用。方法将30只SD大鼠完全随机设计分为5组(每组6只):对照组(Sham)、缺血组(Isc)、缺血+U50,488H组(Isc+U50)、缺血+U50,488H+钙离子通道激动剂Bay k8644组(Isc+U50+Bay)、缺血+Bay k8644组(Isc+Bay)。建立大鼠急性心肌缺血模型,施行30 min心肌缺血前应用U50,488H(1.5 ***-1)及Bay k8644(66.7μ***-1)进行干预,观察各组心律失常发生情况及连接蛋白43(Cx43)在蛋白和基因水平表达的变化。结果①在体动物模型中,Bay k8644可以翻转U50,488H激活κ阿片受体后产生的抗心律失常作用(P<0.05)。②在蛋白表达水平,Bay k8644可以阻断U50,488H对缺血心肌Cx43的保护性上调作用(P<0.01)。③在mRNA表达水平,Bay k8644亦可翻转U50,488H激活κ阿片受体后对缺血心肌Cx43mRNA的调控作用(P<0.01)。结论 U50,488H可通过抑制钙通道减少外钙内流,参与κ阿片受体对缺血心肌Cx43的稳定性调控及抗缺血性心律失常作用。

摘要：目的 构建前列腺特异性双基因表达载体pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43,为前列腺癌基因治疗实验研究奠定基础. 方法获取Cx43基因并克隆至pMD19-T Simple载体;合成HSV-TK基因并克隆到pIRES载体的MCS A中,得pIRES-TK;获取PSMAe/p并克隆至pIRES-TK中替换CMV启动子,得到pIRES-PSMAe/p-TK;将Cx43基因克隆到pIRES-PSMAe/p-TK的MCS B中,得到pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43,对此质粒双酶切鉴定并测序.pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43转染人前列腺癌细胞株LNcap,RT-PCR观察TK及Cx43基因表达. 结果合成的各质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳可见目的 基因条带;pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43经测序与预期设计相符.pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43转染LNCaP细胞,RT-PCR显示成功表达TK及Cx43 mRNA. 结论成功构建了含HSv-TK及Cx43的双基因表达载体pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43.

摘要：背景:细胞移植治疗心肌梗死为重建受损心肌带来希望,但移植后的细胞分化以及细胞移植能否长期持久地改善心脏功能等问题均不明确。目的:观察骨髓单个核细胞经冠状动脉移植入犬梗死心肌后,在心肌组织的分布、分化情况以及对心功能的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-03在泰达国际心血管病医院完成。材料:成年杂种犬16只,随机分为细胞移植组10只、模型对照组6只。方法:细胞移植组于髂前上嵴或髂后上棘穿刺抽取骨髓,经Ficoll密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞,行CM-DiI标记。两组犬均结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,于心肌梗死后2h,细胞移植组向心肌梗死区注射骨髓单个核细胞悬液1mL(3×107～1×108个细胞),模型对照组注射等量生理盐水。主要观察指标:血流动力学指标及超声心动图指标的变化,免疫荧光染色观察骨髓单个核细胞在心脏的迁移、分布及分化结果:与模型对照组比较,细胞移植后6周细胞移植组血流动力学指标左室舒张末压显著降低(P<0.01),心排出量明显升高(P<0.05);超声心动图指标左室收缩末容积、左室舒张末容积均得到显著改善(P<0.01),射血分数、每搏输出量亦明显改善(P<0.05)。自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后,可分布于心肌梗死区及梗死周边区,并表达肌球蛋白重链、连接蛋白43。结论:自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分化为心肌样细胞,改善急性心肌梗死后的心功能。

摘要：目的 :构建携带间隙连接蛋白connexin 4 3(Cx 4 3)cDNA的真核表达载体 ,转染骨髓基质干细胞 ,观察间隙连接蛋白Cx 4 3在骨髓基质干细胞中的过量表达 .方法 :目的基因Cx 4 3cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcD NA3.0 ,转染大鼠骨髓基质干细胞 ,用G4 1 8筛选得到Cx 4 3基因高表达的细胞 ;对照组为pcDNA3.0直接转染骨髓基质干细胞 .结果 :酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3.0 Cx4 3,经G4 1 8筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞 ,免疫细胞化学显示有Cx 4 3蛋白的表达 .结论 :Cx 4 3可以在骨髓基质干细胞中表达 .

摘要：目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。