摘要：背景:胎肝干细胞具有分化成肝细胞、胆管细胞的潜能,参与肝脏的修复与重建,是肝细胞的重要来源,但是人体的胎肝干细胞含量极少,如何获取一定数量和较高纯度的胎肝干细胞是目前研究的热点。目的:构建能有效抑制大鼠胎肝干细胞Cx43基因表达的siR NA载体,探讨抑制Cx43表达对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养鼠胎肝干细胞,设计及合成靶向Cx43的siR NA序列(Cx43-siR NA)以及阴性对照序列(NC-si RNA),采用电转法转染大鼠胎肝干细胞,即为实验组和对照组,未转染的胎肝干细胞为空白组。应用real-time PCR和Western blot法检测转染前后鼠胎肝干细胞Cx43基因和蛋白的表达;细胞生长曲线、CCK-8法观察细胞生长增殖情况;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论:转染Cx43-siR NA后,实验组与对照组、空白组相比Cx43基因和蛋白水平表达均明显降低,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P<0.05),结果表明通过电转法转染靶向Cx43的si RNA能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。

摘要：目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。