摘要：逆转录病毒的活动和多种疾病的发生密切相关,其可通过整合自身基因组到宿主基因组中进行大量有害扩增.与此同时,宿主细胞可根据逆转录病毒的整合位置来启动相关通路抑制其活动.因此整合位点的选择是决定逆转录病毒和宿主命运的关键步骤.尽管国际上已有报道称逆转录病毒在宿主基因组上整合并不随机,并发现了跨逆转录病毒种属的不同DNA基序偏好性,但是这些不足以解释一些基序偏好较弱的逆转录病毒如何获得整合特异性.DNA结构特征,如DNA形状被提出可以影响DNA结合蛋白与DNA结合的亲和力,但DNA形状对不同逆转录病毒整合的影响机制尚不清楚.本研究通过构建QRIS(quantify the retrovirus integration specificity)机器学习框架,定量评估了DNA形状对逆转录病毒整合位点的影响.通过系统地研究跨越四个种属的六种逆转录病毒,本研究发现,DNA形状可以独立地或与DNA基序协同调控逆转录病毒的整合.基于此,可将六种逆转录病毒分为三类:“强兼性偏好型”“弱兼性偏好型”和“强形状偏好型”逆转录病毒.此外本研究发现,即使没有特定偏好的DNA基序,“强形状偏好型”逆转录病毒也可以通过DNA形状获得整合特异性.本文基于机器学习对于大规模逆转录病毒插入位点特性的研究,揭示了DNA结构特征在逆转录病毒致病位点选择中的重要作用.该发现在临床方面为治疗逆转录病毒的策略提供了新靶点和新思路,在应用方面有助于更精确地设计慢病毒载体用于基因编辑和基因治疗.此外,本文建立的机器学习框架也为其他种类病毒的整合特异性研究提供了新方法和新视角.

摘要：目的设计构建趋化因子受体4(CXCR4)的RNA干扰逆转录病毒载体,探讨干扰CXCR4表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。方法用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的Pgensil-1质粒中,再将重组基因片段导入到逆转录病毒真核表达载体PLX-SN中,行限制性酶切及测序鉴定。重组逆转录病毒载体转染包装细胞PA317,获取病毒上清转染前列腺癌细胞,RT-PCR检测CXCR4mRNA表达。Transwell小室侵袭实验检测前列腺癌细胞体外侵袭能力的变化。结果通过酶切及测序鉴定,成功构建了PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4。干扰质粒抑制CXCR4mRNA的表达,与空载体组比较,PC-3m、LNCaPsiRNA对CXCR4mRNA的抑制率分别为(84.26±10.20)%和(88.17±11.23)%。Transwell侵袭实验结果显示,干扰组微膜下孔细胞数PC-3m、LNCaP分别为(14.7±3.1)和(18.9±4.2)个,空载体组分别为(46.9±5.3)和(66.7±6.0)个,两者差异显著(P<0.05)。结论PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4可以有效地抑制前列腺癌细胞CXCR4mRNA的表达,干扰CXCR4可以显著抑制前列腺癌细胞体外侵袭转移能力。

摘要：本实验设计和构建了人促红细胞生成素（Epo）重组逆转录病毒载体（LXSN-Epo）,载体中小鼠白血病病毒长末端调控序列翻译调控人Epo基因的表达。通过重组逆转录病毒,将Epo基因转导到大鼠T和B淋巴细胞中,DNA-PCR分析证明带有人Epo基因的逆转录病毒已整合到T和B淋巴细胞基因中,RT-PCR分析显示了在两种细胞中均表达了 Epo mRNA。体外生物学活性测定显示,在转导的T淋巴细胞培养上清中Epo表达水平高达243mU/ml,在感染的B淋巴细胞培养上清中Epo活性达43mU/ml。在感染的B细胞中,Epo表达在mRNA和蛋白水平均证明了逆转录病毒能有效地和迅速地转导Epo基因到新培养的B细胞中,而不需要药物选择。这些研究开始了逆转录病毒介导的基因转移走向体内Epo基因治疗研究的过程。

摘要：目的　探索急性髓系白血病 (AML)逆转录病毒病因的可能性。方法　运用已获得的逆转录病毒 6 # 11克隆为探针和引物 ,通过Northernblot和RT PCR技术检测AML患者白血病细胞中相关逆转录病毒基因的表达情况。结果　以 6 # 11为探针 ,Northernblot杂交的阳性条带在 9.4kb和 4.5kb左右 ,19例AML患者白血病细胞中 18例出现了阳性条带 ;RT PCR设计的引物扩增片段长度为 790bp ,14例AML患者白血病细胞中阳性表达 11例。结论　AML患者白血病细胞中相关逆转录病毒基因呈特异性表达。

摘要：分别针对编码STLV-1和SRV/D-1两种逆转录病毒膜蛋白的env基因进行引物设计,通过优化、调整PCR条件,建立一种能同时检测猕猴STLV-1和SRV/D-1两种逆转录病毒的多重PCR方法,用于猕猴种群逆转录病毒的常规监测。结果显示多重套式PCR产物片段大小与预期结果一致,进一步测序证实为目的产物,说明建立的多重套式PCR方法能同时检测出猕猴体内可能存在的STLV-1和SRV/D-1两种逆转录病毒。这种方法具有灵敏度高、特异性强、省时、试剂用量少和检测费用低等优点,因此可以作为一种新方法用于猕猴种群逆转录病毒的定性监测。

摘要：目的构建Treg(regulatory T cell)细胞关键转录因子Foxp3逆转录病毒表达载体,并将其转染和稳定表达于Treg细胞中,检测Treg细胞因子改变。方法设计编码区全长序列引物,Hi Fi PCR(high fidelity reverse transcription polymerase chain reaction)扩增编码区序列。胶回收PCR产物,将PCR产物与线性化p SCV-Bsd RFP质粒连接并测序鉴定。将p SCV-Bsd RFP质粒电转入骨架质粒BJ5183,将其转染293病毒包装细胞体系,包装病毒。反复感染4次得到高滴度p SCV-Bsd RFP-Foxp3逆转录病毒液。将此高表达逆转录病毒命名为p SCV-Bsd RFP-Foxp3,感染大鼠脾脏来源Treg细胞,G418筛选稳定表达细胞株。ELISA(enzymelinked immunosorbent assay)检测Treg细胞因子IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的改变。结果 Hi Fi PCR得到编码区全长序列DNA,连接到p SCV-Bsd RFP质粒,测序鉴定扩增序列符合编码区序列。p SCV-Bsd RFP质粒成功转染BJ5183后,转染293病毒包装体系,可见感染细胞有红色荧光表达。p SCV-Bsd RFP-Foxp3病毒感染Treg细胞稳定表达后,可见细胞内红色荧光表达。IL-10和TGF-β表达增强。结论成功构建Foxp3高表达逆转录病毒p SCV-Bsd RFP-Foxp3,转染大鼠脾脏来源Treg细胞并得到稳定高表达Foxp3的Treg细胞。p SCV-Bsd RFP-Foxp3可增强Treg细胞分泌IL-10和TGF-β功能。

摘要：设计质粒pR evT et-O n和pIRES2-EGFP的接头序列,经一系列酶切连接,重组为含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和多克隆位点(M CS)的逆转录病毒载体pR evIRES2-EGFP;同时将质粒pBV 220-IL-2和pEGFP-C 1重组为含有人白细胞介素-2(h IL-2)的过渡质粒pEGFP-C 1-IL-2.再酶切质粒pEGFP-C 1-IL-2,琼脂糖凝胶电泳回收IL-2基因片段,并将其连接到pR evIRES2-EGFP的多克隆位点中,转化*** DH 5α进行扩增,提取质粒DNA获得重组体pR evIRES2-EGFP-IL-2.鉴定结果表明构建的逆转录病毒表达载体pR evIRES2-EGFP-IL-2完全正确.

摘要：背景由于胰岛细胞分离技术难度较大,目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的构建葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础,可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZ1)经EcoR1/BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建逆转录病毒表达载体PLX-GK,用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317,筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系,PCR鉴定。主要观察指标①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果成功构建GK基因逆转录病毒表达载体,经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;产毒细胞系的平均病毒滴度为6.8×108CFU/L,筛选出一株病毒滴度为1.8×109CFU/L稳定产毒细胞系PA317/GK,PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。

摘要：有复制能力的逆转录病毒感染、插入突变、无关序列进入靶细胞是基因治疗潜在的危险,但造成实际危害的可能性极小。完善逆转录病毒载体系统的设计、提高检测有复制能力的病毒的灵敏度将进一步保证基因治疗的安全性。

摘要：目的构建融合表达IL-2和EGFP报告基因的逆转录病毒载体。方法设计载体pRevTet-On和pEGFP-C1的接头序列,经酶切连接重组为过渡载体pRevEGFP-C1,同时对质粒pBV220-IL-2和pEGFP-C1进行酶切,连接重组为过渡载体pEGFP-C1-IL-2。分别酶切质粒pRevEGFP-C1和pEGFP-C1-IL-2,琼脂糖凝胶电泳回收目的片段IL-2,并将其连接到pRevEGFP-C1的多克隆位点(MCS)中,转化至***5α进行扩增,提取质粒DNA获得重组体pRevEGFP-C1-IL-2。结果经分析鉴定,所构建的重组载体pRevEGFP-C1-IL-2完全正确。结论已成功地构建了融合表达IL-2和EGFP的逆转录病毒载体pRevEG-FP-C1-IL-2。