摘要：目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。

摘要：逆转录病毒载体是根据逆转录病毒的特性设计出的一种病毒表达载体,以其能够整合到宿主细胞染色体上并能稳定表达目的基因而被视为基因运载最有效的工具。目前广泛应用于基因治疗、外源基因表达、基因工程疫苗等方面。主要综述了逆转录病毒载体在基因工程疫苗方面的应用现状及前景,为该载体在生物医学领域方面的应用提供有价值的参考。

摘要：朊病毒是引起可传染的致死性海绵状脑病的致病因子,细胞中正常的朊病毒蛋白(PrPC)在该疾病病程发展中起着必不可少的作用。同时,PrPC已被证明在胃癌、乳腺癌等癌症中发挥着保护癌细胞的作用。根据人源PrPC(HuPrPC)cDNA序列,本研究设计了4种19nt的siRNA,将其构建成RNAi逆转录病毒载体系统,进行了其对HuPrPC表达的抑制效应的分析,从中获得了能高效稳定抑制HuPrPC表达的3种靶向序列,其中si626(5′-GGTTGAGCAGATGTGTATC-3′)的抑制效果最为明显,其抑制效率可达85%以上。随后,利用筛选出的si292和si626的稳定干扰细胞系进行了细胞浸润性实验,结果发现,PrPC干扰细胞系细胞浸润能力显著下降。这为进一步研究朊病毒疾病的基因治疗、以PrPC为靶标进行PrPC相关癌症的辅助治疗研究奠定了一定的基础。

摘要：目的:构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA(MDR1),并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法:根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Westernblotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果:重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转入MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDRmRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论:逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。

摘要：目的:利用RNAi表达载体法构建并筛选携带针对CD3ζ基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法:利用DNA重组技术,设计3条60 bp能转录产生靶向CD3ζ小发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,以***+gfp质粒作为空载体经限制性核酸内切酶酶切后与RNAi序列进行重组,构建CD3ζ-pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果:重组载体经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明CD3ζ-pSUPER retroRNAi重组质粒构建成功;脂质体法将重组载体转染包装细胞系PA317,表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论:成功地构建了特异性沉默CD3ζ基因的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ζ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。

摘要：【目的】构建小鼠pMX-H1foo逆转录病毒载体,并使其在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中异位表达,为进一步研究H1foo在重编程方面的作用奠定理论基础。【方法】根据NCBI公布的小鼠H1foo基因的mRNA序列设计引物,以小鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠H1foo CDS序列,并连接到逆转录病毒载体pMX上。经双酶切鉴定和测序比对正确后,利用磷酸钙转染包装细胞plat-E的方法制备H1foo病毒液并感染MEF细胞,进一步收集感染的细胞进行半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测,分析其在细胞中的表达情况。【结果】克隆得到915bp的H1foo基因,构建得到逆转录病毒载体pMX-H1foo。该载体制备的病毒能够感染MEF细胞,并且H1foo在MEF细胞中与细胞核共定位,而对照组绿色荧光蛋白(GFP)遍布整个细胞。【结论】成功构建了pMX-H1foo逆转录病毒载体,并在MEF中进行表达。

摘要：Klf4作为诱导产生多能性干细胞的基因之一,在体细胞的重编程过程中发挥着重要的作用。为构建绵羊Klf4基因逆转录病毒载体,参照本实验室已克隆出的绵羊Klf4基因编码区(GenBank登录号GQ280389)设计引物,将扩增的基因片段经过酶切后亚克隆到逆转录病毒载体pMXs的多克隆位点,经过酶切、PCR和测序鉴定正确后,和包装质粒pVSV-G联合转染293GP细胞获得重组逆转录病毒。通过绵羊胎儿成纤维细胞检测病毒侵染能力,并使用RT-PCR和SDS-PAGE方法检测在包装细胞和被侵染的成纤维细胞中Klf4基因的转录和表达。本试验成功获得具有侵染能力可以表达绵羊Klf4转录因子的重组逆转录病毒,为今后进一步开展以此为基础的绵羊体细胞诱导重编程研究奠定了基础。

摘要：设计含不同FZD 2基因特异性序列的62bp寡核苷酸片段,将其构建到含有H 1启动子并具有绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体pQ supR/F中,将构建好的质粒转染293T细胞。通过酶切鉴定和测序分析,62bp寡核苷酸片段已经成功插入到RNA干扰(RNA i)的逆转录病毒载体中,转染293T细胞,通过绿色荧光可见其转染效率非常高。

摘要：目的克隆、测序人白细胞介素(hIL)-10基因片段,构建逆转录病毒载体(MSCV- hIL-10)。方法采用刀豆蛋白A活化的人外周血单个核细胞培养提取总RNA,设计随机引物并逆转录反应合成hIL-10 cDNA第1链,并以hIL-10特异性引物行PCR扩增,获得hIL-10克隆基因片段,将hIL-10克隆基因片段,经双酶切后定向插入到逆转录病毒载体(MSCV)中,用脂质体法转染PT67包装细胞,以G418筛选阳性克隆。结果聚合酶链反应(PCR)扩增出534 bp特异性片段,测序结果表明同源性与GenBank报道完全一致,hIL-10基因片段插入MSCV载体中经转染包装后得到2×10~7 CFU／ml的分泌hIL-10的病毒悬液,hIL-10的分泌量为1220ng／10~6细胞·d^(-1)。结论成功克隆hIL-10开放阅读框架,成功构建MSCV-hIL-10重组质粒,获得高滴度的分泌hIL- 10的病毒悬液,hIL-10的表达可以应用于移植排斥的基因治疗。

摘要：设计质粒pR evT et-O n和pIRES2-EGFP的接头序列,经一系列酶切连接,重组为含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和多克隆位点(M CS)的逆转录病毒载体pR evIRES2-EGFP;同时将质粒pBV 220-IL-2和pEGFP-C 1重组为含有人白细胞介素-2(h IL-2)的过渡质粒pEGFP-C 1-IL-2.再酶切质粒pEGFP-C 1-IL-2,琼脂糖凝胶电泳回收IL-2基因片段,并将其连接到pR evIRES2-EGFP的多克隆位点中,转化*** DH 5α进行扩增,提取质粒DNA获得重组体pR evIRES2-EGFP-IL-2.鉴定结果表明构建的逆转录病毒表达载体pR evIRES2-EGFP-IL-2完全正确.