摘要：针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。

摘要：神经坏死病毒是导致石斑鱼等多种海水鱼类暴发性传染病的致病原。根据石斑鱼神经坏死病毒编码核衣壳蛋白的RNA2基因组序列设计的一对特异性引物,用来扩增其中的421bp病毒核酸片段。比较了酚-氯仿法、试剂盒法等3种RNA抽提的方法对神经坏死病毒的核酸抽提效果,结果表明3种方法均适合于RT-PCR方法。实验证明在cDNA过程中,RNA酶抑制剂并非反应所必需。对RT-PCR过程进行了条件优化,建立了一步法的RT-PCR检测方法,在网箱养殖石斑鱼以及育苗场的病鱼检测实践中获得满意效果。

摘要：目的　建立检测相关细胞因子的方法。方法　设计 6对用于IFN -γ ,IL - 2 ,IL - 1 0 ,IL - 1 3和 β-actin基因扩增的引物 ,建立可用于相关细胞因子检测的技术。结果　用RT -PCR检测 30例脑囊虫病人外周血单个核细胞发现 2 7例有细胞因子表达 ,3例未检到细胞因子 ,在 2 7例有细胞因子表达的患者中IFN -γ ,IL - 2 ,IL - 1 0IL - 1 3的表达分别为 7例、6例、1 6例、1 7例和 1 4例 ,2 7例均IL - 1 0和 (或 )IL - 1 3表达 ,Th2型细胞因子表达水平明显升高。结论　RT

摘要：目的建立蜜蜂黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)的RT-PCR快速检测方法。方法根据BQCV全基因组序列,在其3′端1 000 bp的区域内设计1对特异性PCR引物,从受BQCV感染的蜜蜂的蛹样品中提取总RNA,进行RT-PCR,并对该法的特异性、敏感性及重复性进行验证。结果从BQCV全基因组序列中可扩增出700 bp的基因条带。该方法可扩增0.1 ng的BQCV DNA;仅能在BQCV中扩增出700 bp的目的基因条带,在蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、蜜蜂囊状幼虫病病毒中均未扩增出目的基因条带;对相同样品进行多次检测,均在700 bp处出现目的条带。结论已成功建立BQCV RT-PCR快速检测方法,该方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于黑蜂王台病的快速诊断和混合感染的鉴别诊断。

摘要：目的:建立乙脑病毒RT-PCR检测方法。方法:参照已发表的乙脑病毒全基因组序列,针对其衣壳蛋白C基因设计1对引物,提取乙脑病毒的RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对90份临床样本进行检测。结果:所建立的乙脑病毒RT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含乙脑病毒衣壳蛋白C基因的重组质粒DNA为模板,最低可检出10pgDNA。90份样本经RT-PCR检测,有23份扩增出特异性的目的条带。从小型猪脑组织中能分离鉴定出乙脑病毒。结论:已建立了乙脑病毒逆转录PCR检测方法,为乙脑病毒检测、流行病学调查奠定了基础。

摘要：参考GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)序列,设计一对CSFV特异性引物;从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA,经逆转录后进行PCR扩增,在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小(168bp)一致的特异性条带,而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性.用此方法对40例盐渍猪肠衣样本进行检测,结果与经典抗原检测方法(抗原捕获ELISA法)一致,而兔体交叉反应试验的阳性检出率为RT-PCR的66.7%,表明本RT-PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测.

摘要：目的:设计以X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)为靶向的shRNA,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其抑制XIAP表达的效应,筛选RNA干扰作用最强的shRNA片段.方法:设计4对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达载体psiRNA-Hhneo-XIAP,通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2细胞中.采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blotting)方法检测XIAP的mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达差异,以判断各shRNA的干扰效应.结果:成功构建含shRNA片段的重组质粒.经质粒测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,XIAP基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强.shRNA作用48h后,对HepG2细胞中XIAP mRNA和蛋白的抑制率与3,4号重组质粒相比,均具有显著性差异(mRNA:94.5% vs 81.5%,82.6%,均PX染色体连锁凋亡抑制蛋白;;短发夹状RNA;;肝癌;;逆转录聚合酶链式反应;;

摘要：以带毒(阳性)和非带毒(阴性)的GF305为试材,利用已建立的总RNA提取方法提取试材中的总RNA,根据3种病毒(ACLSV、PNRSV和PDV)外壳蛋白基因序列设计寡核苷酸引物,采用RT-PCR技术研制3种病毒检测试剂盒,以达到最优化检测。并应用该试剂盒对果园中存在的病毒进行检测。结果显示,该试剂盒检测病毒速度快(6～7h)、灵敏度高(较ELISA法高8 000倍)、专一性强、检测成本较低,是一种有推广价值的核果类果树病毒检测方法。该试剂盒已申报了国家发明专利,初步审查合格。

摘要：用间接ELISA试剂盒对北京市郊区所采集的174份猪血清样品进行了抗体检测,结果显示,其抗体总阳性率达62.1%。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对随即采取的少量猪粪便样品进行了抗原检测。结果表明,部分粪便样品中存在HEV。

摘要：目的建立小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。方法针对MHV核衣壳蛋白基因序列设计6条特异性引物,以MHV基因组RNA为模板,进行RT-LAMP反应。扩增产物通过浊度、SYBR green I荧光染料显色及电泳三种方法观察结果。同时,用限制性内切酶AluI对扩增产物进行酶切鉴定。进行RT-LAMP特异性和敏感性试验。最后用建立的RT-LAMP方法检测55份小鼠临床样本。结果RT-LAMP技术简单快速,等温条件下(65℃)一个小时内即可完成反应。酶切结果证明RT-LAMP产物正确。该技术具有很高的特异性和敏感性,可检测到的MHV RNA最低浓度为0.1 pg/μL,比逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏10倍。临床样本检测结果显示,与RT-PCR比较RT-LAMP方法的敏感性和特异性分别为100%和83.3%。结论RT-LAMP技术是一种快速、简便诊断方法,该方法检测特异性强、敏感性高,可以成为快速准确检测MHV的有效手段。