摘要：利用Ty1／copia类反转录转座子的保守位点设计简并引物，从绿豆(Vigna radiata(L.)Wilczek)基因组中扩增得到了反转录转座子的逆转录酶序列。对扩增得到的约270 bp的片段进行分离和克隆，并随机挑选了40个克隆进行测序，结果得到了36个单独的核酸序列，其中18个含有移码突变或终止子。根据序列比对，这些克隆可分为9组以及单个的9种。这40个克隆中，核酸序列相似性从8％到100％，显示出其核酸序列的高度异质性。将这些克隆的核酸序列与来自其他种植物的相应序列进行谱系分析，发现有些克隆与来自其他种植物的相应序列的亲缘关系比这些克隆之间更为接近。斑点杂交显示Ty1／copia反转录转座子约占绿豆基因组的9．3％。

摘要：在HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)的复制周期中,逆转录酶(reverse transcriptase,RT)和整合酶(integrase,IN)均发挥着非常重要的作用,它们一直是抗HIV药物研究的热门靶点。逆转录酶抑制剂(RT inhibitors)是目前临床上治疗艾滋病(AIDS)患者和HIV感染者的一线药物,而整合酶抑制剂(IN inhibitors)新近也有药物上市,两方面的单独研究均取得了可喜的成果。近年来,多靶点药物研究策略渐渐引起科研工作者的浓厚兴趣,经过合理药物设计及随机筛选发现了多类具有HIV逆转录酶和整合酶双重抑制活性的化合物。本文主要就HIV逆转录酶和整合酶双靶点抑制剂的发现与结构修饰的最新研究进展进行介绍,以期对抗HIV药物研究有所启示。

摘要：利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物,PCR获得MMLV-rt基因片段;再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变,测序正确后,插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt;表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度,再用RT-PCR对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白,通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白,SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%,RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品,为大规模生产该酶提供了可靠的保证。

摘要：根据Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，通过PCR扩增，从黄瓜属野生种酸黄瓜（Cucumishystrix Chakr．）和栽培黄瓜（CucumissativusL．）中均扩增出260bp左右的目标条带。扩增产物经纯化后克隆于pGEM-T Easy质粒载体，选择阳性克隆，再经菌落PCR鉴定，然后进行测序及序列分析，获得了21条来源于酸黄瓜和栽培黄瓜的逆转录酶序列，通过核苷酸聚类分为5个家族。这些核苷酸序列具有较高的异质性，主要表现为缺失突变，序列长度变化范围为255～272bp，同源性范围为27．0％～98．1％。翻译成氨基酸后，有4条序列出现终止密码子突变，6条序列表现出移框突变。将这些逆转录酶的氨基酸序列与已登录的不同物种同一类型逆转录酶的氨基酸序列进行聚类分析，表明它们可能有共同的起源。

摘要：基于生物信息学方法对‘酥梨’基因组中不同类型的逆转录酶进行预测,共获得345条copia类和99条gypsy类逆转录酶。通过系统聚类,copia类逆转录酶可分为Ivana、Ale、TAR、Angela、Maximus和Bianca等6类;gypsy类逆转录酶可分为Athila、Tat、CRM、Reina和Tekay等5类。序列比对结果显示梨中逆转录酶具有较高的异质性,copia类逆转录酶序列分歧度为0.44,gypsy类为0.38。挑选出8类逆转录酶设计引物,并对梨属其它植物进行PCR扩增,结果显示这8类逆转录酶广泛存在于梨属植物中。在砂梨品种‘圆黄’的叶片、种子和果实中均发现该8类逆转录酶存在一定的转录水平,这是首次发现在梨属植物正常生长组织中逆转录酶发生转录。

摘要：为深入了解兴安落叶松的基因组构成及其逆转座子基因的特征,本研究克隆了其逆转座子逆转录酶序列,并进行了生物信息学分析。根据Tyl-copia型逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物,并利用PCR技术获得了26条逆转座子逆转录酶序列。这些序列去除引物后的核苷酸长度范围为237~251 bp,序列间相似度为55.9%~90.9%,可被分为6个家族。氨基酸预测结果显示,有3条序列存在移框突变,9条序列存在终止密码子突变。系统进化分析显示,所克隆的17条没有发生终止密码子突变的序列分别与处于不同进化阶段的其他植物的Tyl-copia型逆转录酶具有共同的起源。研究结果证实兴安落叶松含有类型丰富的Tyl-copia型逆转座子,可为该物种逆转座子基因资源的开发和利用提供依据。

摘要：【目的】从早酥梨及其红色芽变基因组中克隆Ty1-copia反转录转座子逆转录酶序列,分析其特点和差异。【方法】根据Ty1-copia反转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物,建立并优化PCR扩增体系,回收、克隆、测序得到的目的基因序列。【结果】成功从早酥梨基因组和红色芽变材料中分别获得29,30条逆转录酶序列,序列大小均为260bp左右。生物信息学分析表明,与早酥梨相比,红色芽变的逆转录酶序列多发生终止子突变、缺失突变、替换突变。聚类分析可将所得序列分为7个家族,基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示,第7家族序列与苹果和李具有很高的同源性,可能是反转录转座子横向传递的结果。【结论】早酥梨及其红色芽变Ty1-copia反转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点,虽均已不具备转录活性,但红色芽变的逆转录酶序列突变程度更高。

摘要：以辣椒属5个栽培种叶片为试材,利用Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物,PCR扩增后均获得了260bp左右的目的条带。对***的扩增产物进行纯化、克隆和测序,经Mega4和DNAstar软件分析后,获得25条逆转录酶序列,核苷酸序列长度变化范围为225～272bp,这些序列存在高度的异质性,主要表现为缺失突变,同源性范围为23.1%～93.2%,核苷酸聚类分为7个组。翻译成氨基酸后,有9条序列存在1～3个不同程度的终止密码子突变,4条序列存在移框突变。将这25条逆转录酶的氨基酸序列与已发表的不同物种同一类型逆转座子的逆转酶序列进行聚类分析,表明辣椒的Ty1-copia型逆转座子与烟草、矮牵牛、马铃薯有很近的关系。

摘要：背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响。设计:重复测量实验。单位:郑州大学医学院干细胞研究中心。材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者。增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大***馈赠。DH5α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠。方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2mL,经离心、洗涤及传代培养后备用。①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达)。主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果。②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性。③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果。④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果。结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异。②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性。③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性。④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常。⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强。结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。

摘要：植物长末端重复(long terminal repeat,LTR)逆转座子具有普遍性、高拷贝、高异质性和插入多态性,适合开发成分子标记。本研究从栽培种花生(Arachis hypogaea)基因组中获得Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因序列,分析其特点和差异,为基于LTR逆转座子的分子标记开发奠定基础。利用根据Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶基因保守区设计的简并引物对栽培种花生‘桂花1026’品种的基因组DNA进行PCR扩增,目的条带经回收、克隆和测序后,对获得序列进行生物信息学分析。克隆到27条逆转录酶基因序列,序列长度皆为432 bp,AT所占比例为55.32%~66.90%,AT与GC比值为1.24~2.02,核苷酸序列间相似性为44.90%~98.80%,呈现较高异质性;聚类分析后,27条基因序列分为3个家族,家族Ⅰ是主要成分;27条编码蛋白序列的基因中有10条发生了无义突变;基因编码蛋白序列间相似性为34.50%~97.90%,呈现高度异质性;除AhRT2-4外,各基因编码蛋白序列间保守基序完全一致;对栽培种花生和其他物种植物的Ty3-gypsy类逆转座子逆转录酶序列构建系统进化树,进化树显示所有序列被分为6类,其中,Ⅰ类包含19条其他植物物种和1条栽培种花生的序列,Ⅱ类包含8条其他物种和7条栽培种花生的序列,表明栽培种花生逆转录酶序列具有较高的保守性,栽培种花生逆转录酶基因编码蛋白序列与绿豆(Vigna radiata)、枣(Ziziphus jujuba)、黄瓜(Cucumis sativus)、油棕(Elaeis guineensis)、火龙果(Hylocereus undatus)等植物的逆转录酶序列亲缘关系较近,表明不同植物的Ty3-gypsy逆转座子之间可能存在着水平基因转移;通过比对花生EST数据库,发现了4条具有转录活性的栽培种花生Ty3-gypsy类逆转座子。本研究所获得的逆转录酶基因序列可为栽培种花生Ty3-gypsy逆转座子的分子标记开发利用及分子育种奠定一定基础。