摘要：目的　构建一个含 16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库。方法　设计合成编码 16肽的随机DNA片段 ,PCR扩增随机DNA片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH RP并检验其库容。结果　扩增获得编码 16肽的随机DNA片段 ,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,与GAL4AD形成融合蛋白 ,其库容为 1 2 8× 10 7。

摘要：水稻OsJAG是一个重要的C2H2型锌指蛋白,在水稻花器官发育,特别是浆片和雄蕊的确定中具有关键作用,但与之相互作用的蛋白质却鲜有报道。本研究利用酵母双杂交方法,以OsJAG为诱饵蛋白,从水稻明恢86的幼穗cDNA文库中筛选到38个与OsJAG有相互作用的蛋白质,包括3个GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu)脂酶家族成员(OsGELP95,OsGELP67和OsGELP6)、2个线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白(OsVDAC1和OsVDAC2)、受harpin诱导的蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和泛素化相关蛋白等。通过双分子荧光互补技术对部分蛋白的互作进行了验证,结果显示OsJAG与OsGELP95、OsGELP67、OsVDAC1和OsVDAC2均存在相互作用。本实验为深入研究OsJAG在水稻生殖发育和花器官特化的遗传调控机制提供了理论参考。

摘要：为了鉴定胞内劳森菌(Lawsonia intercellularis,LI)外膜蛋白LI0902在细菌感染中的作用,本试验以胞内劳森菌疫苗DNA为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并成功构建诱饵表达载体pGBKT7-LI0902。将通过菌落PCR和测序验证的质粒转化酵母菌株Y2H Gold后,发现LI0902能在酵母细胞中正确表达,对酵母细胞无毒性,且无自激活活性。将含有pGBKT7-LI0902的酵母菌株Y2H Gold与猪肠上皮细胞系IPEC-1 cDNA文库菌株Y187进行杂交,筛选、验证、测序后得到3个与LI0902相互作用的宿主蛋白。本试验研究了胞内劳森菌与猪肠上皮细胞相互作用,为揭示增生性肠炎的致病机理提供了线索。

摘要：【目的】低温和高光均能引起四季秋海棠(Begonia semperflorens)叶片因合成积累花色素苷而变红。本研究从低温和高光处理四季秋海棠的转录组中筛选并克隆得到1个MYB转录因子基因并命名为BsMYB62,对其进行生物学信息分析,并从四季秋海棠cDNA文库中筛选出与其互作的蛋白。【方法】设计BsMYB62引物,克隆BsMYB62 CDS区,利用生物信息学软件对BsMYB62基因序列及其编码蛋白序列分析。构建pGBKT7-BsMYB62酵母双杂交诱饵载体,对该诱饵载体进行毒性和自激活检测后,用Mating法筛选BsMYB62的互作蛋白。【结果】BsMYB62基因的CDS区为801 bp(NCBI登录号:MT560845),编码266个氨基酸。pGBKT7-BsMYB62有自激活现象,对宿主酵母菌无毒性。在含45mM 3-AT的SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上能明显抑制BsMYB62蛋白的自激活。酵母双杂交结果显示与BsMYB62蛋白互作的蛋白有9类,分别是XTH9、LHB1B2、EBS7、PSI-F、UBE2、FDH、RBCS1A、FP6和BCA。【结论】推测四季秋海棠BsMYB62蛋白与以上9类蛋白互作响应低温、高光胁迫。

摘要：通过酵母双杂交系统,以ATP6作为诱饵蛋白筛选与ATP6有相互作用的蛋白质.通过筛选和鉴定,获得了5个与ATP6有相互作用的蛋白质.其中一个与拟南芥中内质网膜上的蛋白转运复合体中的α亚基(Sec61α)有很高的相似性.通过TAIL PCR和设计简并引物扩增初步得到了甘蓝型油菜Sec61α全长基因组序列和cDNA序列.并利用生物信息学分析手段对甘蓝型油菜Sec61α进行了比对和分析,推测该蛋白质可能参与了花粉的发育过程.

摘要：背景:酵母双杂交技术是目前应用最成功的研究蛋白质相互作用的技术平台。目的:运用SMART(switching mechanism at5′end of RNA transc-ript)技术构建人肺鳞状细胞癌旁组织的酵母双杂交cDNA文库。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-01在四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学感染免疫实验室完成。材料:人肺鳞状细胞癌旁组织由四川大学华西医学中心附属第一医院胸外科提供。方法:运用SMART技术,以纯化的Poly(A)+RNA为模板,用Powerscript逆转录酶进行转录,并在mRNA的5’末端添加一段5’-oligo作为延伸后的模板,从而富集全长cDNA。纯化的双链cDNA与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态AH109,经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人肺鳞状细胞癌旁组织cDNA文库。主要观察指标:采用琼脂糖凝胶电泳观察人肺鳞状细胞癌旁组织的cDNA文库构建结果,并进行文库容量及多态性鉴定。结果:①总RNA和mRNA纯度较好,比较完整。②双链cDNA文库大小介于0.5～3kb之间。③共获得1.2×106转化子,重组子不同插入片断大小在0.3～2kb之间,文库具有较好的多样性。结论:在酵母菌株AH109成功构建了用于酵母双杂交的人肺鳞状细胞癌旁组织cDNA文库。

摘要：为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7-GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×107 cfu·mL-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。

摘要：为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。

摘要：【目的】从番木瓜4个不同成熟期果实的转录组中筛选并克隆得到1个转录因子CpMYB114L,构建番木瓜果实的cDNA文库,筛选与CpMYB114L互作的蛋白,探究CpMYB114L参与调控果实成熟的分子机理。【方法】以番木瓜‘GZBG’品种的果实为材料,设计特异引物,克隆CpMYB114L CDS区,利用生物信息学软件分析该基因序列及其编码的蛋白序列。提取番木瓜不同成熟期果实的总RNA,利用all-direct法建立酵母双杂交cDNA文库。构建pGBKT7-CpMYB114L诱饵载体,对其自激活检测后,通过共转化从文库中筛选CpMYB114L互作蛋白。通过在NCBI网站上进行序列比对,明确互作蛋白的功能分类,最后对各类蛋白基因在番木瓜不同成熟期果实中的表达进行分析。【结果】CpMYB114L基因的CDS序列编码227个氨基酸,预测其相对分子质量为26304.3,理论等电点为6.23,亲水性总平均值为-0.893。CpMYB114L蛋白序列与甜樱桃(PaWERL)、蒺藜苜蓿(MtMYB1)、黧豆(MpMYB113)、大豆(GmMYB1)和苹果(MdMYB308L)的同源性较近。cDNA文库总库容为1.15×10^(7) CFU,重组率100%,插入片段长度为750~2000 bp。诱饵载体pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活。从酵母双杂交文库中筛选到30个初始阳性克隆,经回转验证后最终获得26个与CpMYB114L互作的蛋白,共分为4类,包括乙烯响应受体1(CpERS1)、酰基辅酶A硫酯酶13(CpAcots13)、热休克蛋白42(CpHSP42)和叶绿体转运子159(CpTOC159)。在果实成熟过程中,CpERS1和CpHSP42表达量先上升后下降,CpAcots13表达量持续上升,CpTOC159表达量剧增后趋于平稳。【结论】推测CpMYB114L与CpERS1蛋白互作参与番木瓜果实成熟的调控。

摘要：通过对辣椒全基因组数据库分析获得黄灯笼辣椒eIF4E基因家族的四个基因,设计两端带有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物分别扩增四个基因的ORF,克隆到LexA-酵母双杂交系统的激活域载体pB42AD中,并构建pB42AD-eIF4E、pB42AD-eIF(iso)4E、pB42AD-eIF4E-Xm、pB42AD-n CBP9090重组载体。将重组质粒导入酵母菌株EGY48(p8op-Lac Z)中,进行重组激活域载体的毒性检验和自激活验证。结果表明,扩增获得了正确的黄灯笼辣椒Cc-eIF4E、Cc-eIF(iso)4E、Cc-eIF4E-Xm、Cc-n CBP9090基因ORF,并成功克隆到pB42AD载体中,同时转化有激活域载体的EGY48(p8op-Lac Z)在SD/-Trp/-Ura营养缺陷型平板上生长良好,在SD/-His/-Ura平板上不生长,说明重组质粒表达产物对该酵母细胞无毒性,对下游报告基因无自激活作用。本研究结果证明pB42AD-eIF4E、pB42AD-eIF(iso)4E、pB42AD-eIF4E-Xm、pB42AD-n CBP9090重组载体可用于该系统的互作蛋白筛选,为下一步通过酵母双杂交系统筛选与黄灯笼辣椒eIF4E家族蛋白相互作用的病毒蛋白奠定基础。