摘要：目的:用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法:根据GenBank中提供的DAT1序列设计引物,以小鼠脑组织cDNA文库为模板,PCR扩增DAT1,并与pLexA载体连接,测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48,在选择性培养基上观察pLexA-DAT1在EGY48中的表达。结果:PCR扩增出的DNA片段约490bp,大小正确,构建的融合表达载体pLexA-DAT1,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD/Gal/Raf/-His/-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝,证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p8op-LacZ报告基因的能力,可以用作进一步的实验。结论:获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。

摘要：根据Genebank,设计β3膜外区引物,通过RT PCR方法扩增β3片段,然后克隆入RRS酵母双杂交载体——pYesM△playA中,构成猎物.限制性内切酶酶切鉴定表明载体构建正确,β3整合素测序正确.表明成功扩增出人β3整合素基因胞外区,构建获得β3pYesM△playA酵母表达载体.用乙酸锂法,将重组子转染至酵母温度敏感株cdc252,检测其对RRS系统的激活作用.自激活试验为阴性表明β3整合素不能自激活cdc252在36℃生长,表明该载体可用于酵母双杂交检测β3整合素与汉坦病毒受体结合蛋白(VAP)间相互作用.为进一步研究β3整合素在病毒感染中的作用奠定了基础.

摘要：为了深入研究铜绿微囊藻生物钟调控的分子机制,根据蓝藻钟基因的同源序列设计合成了简并引物,通过PCR和染色体步行的方法获得了铜绿微藻Microcystis aeruginosa PCC7820的生物钟基因簇kaiABC。kaiA基因全长873bp,编码一个由290aa组成,分子量大小为33.3kDa的蛋白;kaiB基因全长315bp,编码分子量大小为11.8kDa的蛋白;kaiC基因全长1563 bp,编码蛋白分子量大小为58.3kDa。Kai蛋白间的相互作用是昼夜节律计时产生的重要过程,利用酵母双杂交系统检测了三种Kai蛋白间的相互作用,结果表明KaiA、KaiB和KaiC蛋白自身及KaiA与KaiC、KaiB与KaiC之间都能发生明显的相互作用,而KaiB和KaiA之间没有检测到相互作用。

摘要：优质牡丹花型育种是牡丹产业发展遭遇的瓶颈问题之一。本研究以牡丹(Paeonia sufruticosa)单瓣和雄蕊瓣化品种为植物材料,以调控牡丹雄蕊发育相关的关键基因PsAP3为切入点,通过基因克隆、亚细胞定位、表达分析初步解析了牡丹PsAP3基因的功能,筛选了PsAP3可能存在下游互作基因,构建了TRV2-PsAP3沉默载体并成功转化农杆菌,用于后续牡丹瞬时沉默试验。结果显示:牡丹PsAP3基因全长612 bp(GenBank登记号:MT225537),编码203个氨基酸,分子量为23891.18,属亲水蛋白,含有一个MADS结构域和一个K结构域。系统进化分析表明PsAP3与栓皮栎亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示PsAP3蛋白定位在细胞核中。表达分析结果显示,与单瓣品种的雄蕊相比PsAP3在雄蕊瓣化品种的内瓣中表达量显著提高,这也预示着可能是PsAP3基因在在花器官中表达扩张,在雄蕊中显著高表达导致了牡丹的雄蕊瓣化现象。酵母双杂交结果表明PsAP3编码的蛋白与PsAP1-1、PsPI、PsSEP、PsAG编码的蛋白互作。本研究初步解析了牡丹PsAP3的功能,为牡丹雄蕊瓣化分子机理的揭示提供理论依据,并为进一步精细化调控牡丹花型奠定理论基础。

摘要：根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因(MDP0000662999),暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F_1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24℃下的愈伤组织相比,低温(8℃)诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。

摘要：为研究SPT和HEC及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响,以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料,提取雌蕊总RNA,根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物,采用同源克隆方法克隆SPT基因,其序列1085 bp,开放阅读框(ORF)1062 bp;HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明,SPT编码353个氨基酸残基,预测分子量为37.67 kD,pI为6.83;HEC1编码231个氨基酸残基,预测分子量为25.26 kD,pI为10.2。两基因在各器官中均表达,但SPT在果实和雌蕊中表达量最高,而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用,构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1,pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体,分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象,融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑,表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因,酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致,说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。

摘要：【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。

摘要：神经轴突生长抑制因子Nogo-B在体分布广泛,提示其除了具有抑制中枢神经系统轴突再生作用外,可能还扮演其他重要的功能角色。该研究为探讨Nogo-B下游新的结合分子及其功能开展相应研究。通过设计诱饵蛋白筛选人脑cDNA文库、免疫共沉淀方法,寻找Nogo-B下游结合分子;通过流式细胞术,检测结合对于细胞凋亡的影响;通过绿色荧光蛋白标记和免疫组织化学方法,探讨Nogo-B诱导细胞凋亡的机制。结果提示,Clusterin除了与Nogo-66功能域在酵母双杂交系统中存在结合,与Nogo-B在哺乳细胞中也能发生结合。过表达Nogo-B可明显诱导HEK293细胞凋亡,与Clusterin共表达可下调早期细胞凋亡率,但后期Nogo-B可通过调节Clusterin由胞浆到胞核转位,进一步诱导细胞凋亡进程。该研究首次提出Nogo-B与Clusterin之间存在结合,且结合参与了Nogo-B诱导的细胞凋亡进程。

摘要：目的筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒性检测;建立布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞模型,构建布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;采用酵母双杂交技术筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白,实时定量PCR检测靶蛋白表达量的变化。结果成功构建了pGBKT7-virB4诱饵质粒,转入Y187后无毒性,不能自激活;获得了布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;筛选到了13个阳性质粒,其中蛋白辅酶Q10和SLC3A2在布鲁氏菌侵染后mRNA表达量均增加。结论本试验对VirB4蛋白与宿主细胞的互作研究为进一步阐明布鲁氏菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。

摘要：目的利用酵母双杂交技术筛选线粒体促凋亡因子野生型Smac/DIABLO的相互作用蛋白。方法①设计促凋亡因子野生型Smac/DIABLO引物,利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增野生型Smac/DIABLO基因片段,构建酵母真核表达载体pDBLeu-Smac/DIABLO。②pDBLeu-Smac/DIABLO诱饵质粒转化酵母MaV203,Western blot检测融合蛋白在酵母中的正确表达,自激活作用的检测并确定抑制His基础表达的3AT浓度。③对成人肝cDNA文库的筛选。选择能同时激活His、Ura、LacZ3个报告基因的克隆为阳性,利用回转实验和GST-pull down对阳性克隆进行鉴定。结果成功构建pDBLeu-Smac/DIABLO载体,转化酵母细胞MaV203,无细胞毒性,无自激活作用,3AT浓度为25mmol/L。经回转实验和GST-pull down证实了线粒体促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1之间具有相互作用。结论Smac/DIABLO可能通过与核受体NR4A1的相互作用来影响核受体NR4A1对细胞生存或者凋亡的调控。