摘要：以普通六倍体小麦品种德抗961为材料,根据野大麦HbCIPK2的mRNA序列(GenBank序列号JN831652)设计引物,采用同源克隆方法从小麦中克隆TaCIPK2基因(GenBank序列号KU640381),测序结果显示该基因序列全长1421bp,开放阅读框(ORF)1359bp,编码452个氨基酸残基,预测分子量为50.91kD,pI为9.07。氨基酸序列比对结果表明:该基因与HvCIPK2(KP638475.1)、TaCIPK2(KJ561791.1)、HbCIPK2(JN831652.1)的相似度分别为94.69%、96.93%、95.80%,具有高度同源性;系统进化分析表明它们位于相同进化支上,亲缘关系最近。采用Real-timePCR方法分析不同逆境胁迫处理下TaCIPK2基因表达的特异性,200mmol/LNaCl高盐胁迫处理小麦幼苗后根和叶部TaCIPK2基因均上调表达;4℃低温胁迫处理后根部TaCIPK2基因上调表达,而叶部下调表达;100μmol/LABA胁迫处理后根和叶中TaCIPK2均上调表达。为检测TaCIPK2与TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6、TaCBL7的相互作用,构建酵母表达载体pGADT7-TaCIPK2,转化酵母Y187感受态细胞;同理pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6、pGBKT7-TaCBL7转化到酵母细胞Y2Hgold中,都没有出现自激活活性和毒性现象。共转化的二倍体酵母,只有pGADT7-TaCIPK2×pGBKT7-TaCBL2和pGBKT7-53×pGADT7-T在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA培养基板上长出的菌落呈现蓝色,说明TaCIPK2能够与TaCBL2相互作用,激活下游报告基因HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2的表达,该研究结果对进一步研究TaCIPK2的功能有一定的指导意义。

摘要：目的构建E2F-1截短体的诱饵载体,并进行自激活活性和诱饵蛋白毒性检测,为应用酵母双杂交系统筛选与E2F-1相互作用蛋白建立实验基础。方法设计引物,PCR扩增E2F-1截短体,引入酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ,将E2F-1截短体连接至载体pGBKT7中,将构建成功的诱饵表达载体pGBKT7-E2F-1截短体转化到酵母菌AH 109中,采用选择性培养皿和β-半乳糖苷酶分析等方法分析检测重组质粒的自激活活性和细胞毒性。结果成功扩增了E2F-1截短体,并连接至载体pGBKT7中,测序比对结果正确,成功转化到酵母菌AH 109中,经检测无自激活活性和细胞毒性。结论成功构建了E2F-1截短体的诱饵载体,经检测无自激活活性和细胞毒性,可应用于酵母双杂交系统筛选与E2F-1相互作用的蛋白。

摘要：根据水稻数据库中过氧化氢酶基因编码序列设计引物,克隆水稻Os CATA基因全长序列,构建无自激活活性的p GBKT7-Os CATA诱导重组质粒,采用酵母双杂交系统筛选水稻2周龄叶片c DNA文库。结果表明,对84个阳性克隆测序,比对分析得到13种可能与Os CATA基因存在相互作用的蛋白质,这些蛋白与叶绿素合成前体、胁迫相应蛋白、核糖体蛋白、外膜蛋白、分泌蛋白、ATP酶和G蛋白β亚基等相关。不同时期过氧化氢酶基因表达分析显示,Os CATA基因在幼苗期和抽穗期表达较高,Os CATB基因在乳熟期和完熟期中表达较高,Os CATC基因在幼苗期和扬花期表达较高。

摘要：核蛋白(NP)是流感病毒的主要结构蛋白,其与RNA依赖性的聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)及vRNA构成核糖核蛋白复合体,参与流感病毒复制过程中的多个阶段。宿主因子着丝粒蛋白V(CENPV)在细胞生命周期中发挥重要作用,但是目前尚未见关于CENPV蛋白与流感病毒NP蛋白相互作用的报道。为研究宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白相互作用机制,本实验利用酵母双杂交技术筛选与NP蛋白相互作用的CENPV,利用酵母回交验证,结果显示CENPV与NP诱饵质粒共同转化Y2H酵母感受态细胞,在DDO、QDO和QDO/X/A 3种营养缺陷型的培养基上均能生长,并使菌落呈现蓝色,与阳性对照结果一致,而阴性对照组在QDO和QDO/X/A培养基上均未观察到菌落,表明在酵母系统中宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用。将pCAGGS-CENPV-Myc(1μg)表达质粒与pCAGGS-NP(1μg)质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)检测,结果显示鼠抗NP MAb仅可结合CENPV与NP共转染组中的CENPV,表明宿主蛋白因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在相互作用;进一步利用激光共聚焦试验检测,结果显示在A549细胞中宿主因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在共定位。根据人CENPV序列设计合成CENPV的特异性siRNA,利用RNAiMAX将CENPV siRNA转染A549细胞,48 h后进行细胞活力测定和病毒感染试验,结果显示利用siRNA干扰技术下调CENPV表达后对细胞活力无影响,但可促进流感病毒在A549细胞中的复制。以上研究结果首次证实宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用,并且调控流感病毒的复制。本研究进一步完善了流感病毒NP蛋白与宿主因子的相互作用网络,为宿主因子调控流感病毒复制研究提供参考。

摘要：AP2转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,为深入研究蒺藜苜蓿MtAP2转录因子的功能,于蒺藜苜蓿中克隆MtAP2转录因子,进行生物信息学分析,构建诱饵表达载体PGBKT7-MtAP2并转入酵母菌中,进行自激活活性检测。结果显示,本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtAP2转录因子,其开放阅读框为624 bp,编码207个氨基酸。生物信息学分析显示,蒺藜苜蓿MtAP2蛋白与鹰嘴豆的亲缘关系最为接近。诱饵表达载体PGBKT7-AP2构建成功,转入到Y2H酵母菌中,且通过在营养缺陷型培养基培养证明其没有自激活活性。本研究成功克隆了蒺藜苜蓿MtAP2转录因子,构建了酵母诱饵表达载体PGBKT7-MtAP2,并证明其不存在自激活现象,后续可进行互作蛋白筛选。