摘要：目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氰酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂（GAPDH/CPI）复合基因真核重组表达质粒,为研制复合多价疫苗奠定基础.方法 依据GenBank中BmGAPDH及BmCPI基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克降后,克隆至载体pGEM-T Easy中.取阳性重组质粒pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI以及真核重组表达载体分别双酶切,将酶切后的载体和目的 片段进行连接,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1（＋）/BmGAPDH/BmCPI.将复合基因重组质粒瞬时转染人HeLa细胞后,进行RT-PCR验证,将表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析和鉴定.结果 分别克隆了pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI重组质粒,经酶切鉴定分别得到877、621 bp特异性片段,与预期值吻合.成功构建了复合基因重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）/BmGAPDH/BmCPI,酶切鉴定所产生的片段大小与预期吻合.复合基因真核重组表达质粒转染HeLa细胞后得到高水平表达,SDS-PAGE分析显示重组蛋白相对分子质量（Mr）约为54×103.结论 成功构建了周期型马来丝虫GAPDH/CPI复合基因重组表达质粒,并在哺乳动物细胞内得到正确表达.

摘要：目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化***21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌***5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化***21(DE3),在得到的转化子***21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株***21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株***5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。

摘要：背景:为了深入研究磷酸蔗糖变位酶基因psm与变形链球菌***致龋性之间的关系,需要利用同源重组原理构建psm基因功能丧失菌株,因此构建一个符合同源重组条件的合格质粒载体就成为实验工作的重要前提。目的:构建变形链球菌*** UA159psm的两种同源重组质粒。设计、时间及地点:于2005-12/2006-07在北京大学医学部病原微生物实验室完成的单一样本观察实验。材料:实验所用口腔链球菌均来自四川大学华西口腔医学院微生物实验室。方法:首先应用Southern Blot对psm基因的保守性进行分析,再将*** UA159psm基因内部序列分别克隆至自杀质粒pSF151和pVA981上的多克隆位点,构建重组质粒。主要观察指标:psm基因的保守性及重组质粒pSF151及pVA981的构建结果。结果:psm基因在实验中所列8种***中保守存在;经过聚合酶链反应和酶切分析,两个重组质粒所插入片断无误。重组质粒pSF151(空质粒大小为3.5kbp)和pVA981(空质粒大小为7.1kbp)构建成功。结论:两种可以用于转化*** UA159的重组质粒的构建可用于今后*** UA159psm基因功能的研究,且重组质粒大小是否影响转化效率需后续观察。

摘要：背景:烧创伤后创面愈合多伴有瘢痕增生,内皮细胞在瘢痕增生中具有重要作用,抑制内皮细胞的生长可以在一定程度上减轻瘢痕增生。目的:构建含有人内皮抑素基因的重组腺病毒Ad/hEnd,并观察与感染该病毒的角朊细胞共培养时内皮细胞增殖特性的改变。设计、时间及地点:观察对照实验,于2006-09/2007-05在解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所国家重点实验室完成。材料:pAdTrack-CMV及pAdEasy-1购自美国Stratagene公司;293细胞及大肠杆菌***5α由本室保存。方法:以人胎肝组织mRNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应及聚合酶链反应获得内皮抑素基因序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组质粒pAdTrack-ES。经鉴定后将阳性重组子转化至pAdeasy1受体菌,筛选阳性克隆。脂质体介导转染293细胞,获取Ad/hEnd,经聚合酶链反应鉴定及上清中内皮抑素含量检测后,感染角朊细胞,采用套皿法与内皮细胞共培养。并与未转染的角朊细胞进行对照观察。主要观察指标:pAd/hEnd的同源重组及其鉴定,Ad/hEnd的产生与鉴定,转染293细胞后内皮抑素的表达,Ad/hEnd的纯化与滴度测定,培养液中内皮抑素含量,内皮细胞凋亡百分数及内皮细胞抑制率测定。结果:①成功获取了Ad/hEnd,病毒滴度可达1.65×1012PFU/L。②感染Ad/hEnd的角朊细胞可有效表达并分泌内皮抑素,连续培养3d后,培养液中内皮抑素含量可达226μg/L。③与转基因角朊细胞共培养的内皮细胞凋亡百分数与细胞抑制率均显著高于对照组(P<0.05)。结论:与内皮细胞共培养时,转Ad/hEnd角朊细胞可通过分泌内皮抑素促进内皮细胞凋亡,并抑制其增殖。

摘要：背景:目前应用于基因治疗的病毒载体中,重组腺相关病毒载体2型载体与腺病毒和反转录病毒载体比较,由于其无致病性,引起学者们的关注。目的:观察体外重组腺相关病毒载体2型转染骨髓间充质干细胞,并用其作为携带基因表达的载体进行急性髓性白血病基因治疗的可能性。设计:开放性实验。单位:南方医科大学南方医院的血液科。材料:实验于2004-02/07在南方医科大学南方医院的血液科实验室完成。本实验所用的骨髓间充质干细胞来自急性髓性白血病6例初发患者和4名健康成年志愿者的第3～5代传代细胞。方法:从初发的急性髓性白血病患者和正常健康志愿者髂后上棘做骨髓穿刺抽取6～10mL肝素抗凝的骨髓,分离培养出间充质干细胞,用包含增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型感染间充质干细胞,将获取的骨髓间充质干细胞加入含一定感染复数(感染复数=1×102,1×103,1×104,1×105,1×106,1×107)的增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型病毒载体的不完全培养液,10～14d后在相差荧光显微镜下或用流式细胞仪观测绿色荧光蛋白的表达。在体外培养条件下观察绿色荧光蛋白在经过重组腺相关病毒载体2型转导的骨髓间充质干细胞中的表达。体外观察经增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型转导并被新霉素筛选后绿色荧光蛋白在被转导的骨髓间充质干细胞中的表达。通过相差荧光显微镜下确证绿色荧光蛋白表达后,在BD流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标:①增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对骨髓间充质干细胞的转染率分析。②在转染后的不同时间点用相差荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①转染率分析:增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型对来源于健康志愿者和急性髓性白血病患者的骨髓间充质干细胞的转染率均不高,转染率在0.3%～1.4%。转染后10～14d绿色荧光蛋白开始表达,一般感染条件绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞所占比例为(1.030±0.034)%,重复3轮感染条件下为(1.140±0.036)%,脂质体协助感染条件下为(1.380±0.054)%,改变转染条件(包括重复感染,延长感染时间,增加感染复数,脂质体协助转染)亦不能明显增加转染率(P>0.05),而增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体2型却能高效的转染其包装细胞293细胞。②绿色荧光蛋白在体外长期稳定表达分析:实验观察61d内,绿色荧光蛋白保持低水平长期稳定表达,在转染后的12～33d,绿色荧光蛋白阳性的骨髓间充质干细胞从起始时的1.16%下降到0.5%～0.6%,33～61d一直维持在这一水平;经过新霉素筛选30d后,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞达到6.6%左右,在体外继续传代培养,在体外观察的100d中,表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞一直维持在6%的水平。结论:重组腺相关病毒载体2型介导的基因转导的优势是安全、无免疫反应,目的基因能够长期稳定表达。重组腺相关病毒载体和骨髓间充质干细胞可用于体外基因治疗,其将来可能成为全身基因治疗的良好载体。

摘要：目的:探讨10-23 DNA enzym e对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的特异切割活性。方法:设计并合成3种能针对乙型肝炎病毒C基因开放阅读框A1816UG的特异性脱氧核酶,分别命名为D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9。应用体外转录的方法获得相应的底物RNA,观察D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9对其的体外切割效应。以D rzBC-9为例,观察不同浓度的M gC l2对体外切割效率的影响,根据L inew eaver Burk作图法,计算相关的酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km。结果:通过体外转录获得用于切割反应的底物RNA,其大小为300 nt。在特定的切割条件下,D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9均能对相应的底物RNA进行有效的切割,切割产物分别为109 nt和191 n。t以D rzBC-9为例,在切割反应体系中缺乏M gC l2时,未见有切割反应。M gC l2浓度在150 mm ***-1时达到最高切割效率,再提高M gC l2的浓度,切割效率未见明显增大。酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km分别为1.4×10-9m ***-1,1.6 m in-1和1.1×109m ***-1.m in-1。结论:针对乙型肝炎病毒C基因的10-23 DNA enzym e在体外对相应的转录产物有特异切割作用。

摘要：目的:重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用.方法:根据MDR1基因序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列(sh-MDR1-1,sh-MDR1-2),重组构建psh-MDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC-7721/R,用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的潴留.结果:PCR和DNA测序证实了psh-MDR1-1和psh-MDR1-2重组质粒的成功构建,均能有效地抑制细胞P-gp表达;转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性,P-gp表达水平明显降低,细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高;第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论:体外完成shRNA RNAi载体的构建,能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达,抑制P-gp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi,能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.

摘要：【目的】构建含有APC蛋白功能区域的pEGFP-N3-APC重组质粒,转染结肠癌细胞HT-29,观察重组质粒的表达。【方法】设计引物分别扩增5条APC基因功能区域片段。将扩增片段与pEGFP-N3载体连接后挑取阳性克隆,行菌落PCR和测序鉴定。使用Lipofectamine 2000将重组质粒转染结肠癌细胞株HT-29,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。【结果】构建5条带有APC不同结构域重组真核表达载体pEGFP-N3-APC,重组真核表达载体转染HT-29细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达。【结论】真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能提供了基础。

摘要：[目的]构建重组乙酰胆碱受体亚单位-BirA识别多肽序列基因(pcDNA 3.1-AChR-αBirA),并对其进行真核基因表达.[方法]设计引物生物素蛋白连接酶(BirA)识别多肽序列基因,将载体pcDNA3.1-AChR-αBirA识别多肽序列基因连接,并用EcoRⅤ单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性,并测定序列进行验证.将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上进行表达,经激光扫描共聚焦显微镜验证其产物.[结果]电泳检查可见大小为63 bp的条带,经测定序列验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因;转染后经激光扫描共聚焦显微镜观察到CHO细胞膜上的绿色荧光.[结论]成功构建了AChR-αBirA识别多肽序列基因重组载体,并可在CHO细胞中较好地表达.