摘要：[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。

摘要：目的本研究利用RNA干扰技术,以粘附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)为靶基因,设计构建重组体,并对重组体进行鉴定,为下一步探索心肌纤维化的新途径奠定基础。方法设计小发夹结构四条DNA序列,经退火成互补两对双链,再克隆到载体PAVU6+27中构建重组体,转化入JM109菌株,提取质粒进行酶切鉴定、测序分析。结果酶切鉴定和测序分析均提示FAK靶向RNA干扰重组体的构建成功。结论FAK靶向RNA干扰重组体的成功构建,为下一步利用该重组体沉默心脏成纤维细胞中FAK基因的表达,探索心肌纤维化机制打下基础。

摘要：目的 :本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因 ,设计构建重组体 ,并进行序列分析 ,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法 :设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体pTZU6 +1中构建重组体 ,转化JM10 9菌株 ,提取质粒行酶切鉴定后 ,进行测序分析。结果 :将合成的DNA序列退火后克隆到载体上 ,经测序鉴定确实为所需序列。结论 :DNMT1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析 ,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰DNMT1的mRNA转录 。

摘要：目的　本研究利用RNA干扰 (RNAinterfering ,RNAi)技术 ,以MBD2 (methylCpG bindingdomain 2 )为靶基因 ,设计构建重组体 ,并进行序列分析 ,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法　设计有小发夹结构的两条DNA序列 ,经退火成互补双链 ,再克隆至载体 pTZU6 +1中构建重组体 ,转化JM1 0 9菌株 ,提取质粒行酶切鉴定后 ,进行测序分析。 结果　将合成的DNA序列退火后克隆到载体上 ,经测序鉴定确实为所需序列。结论　MBD2靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析 ,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中MBD2的mRNA转录 。

摘要：目的克隆人干燥综合征B抗原基因(human sjogren’s syndrome antigen B,SSB)并进行原核表达,为使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSB cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,逆转录RT-PCR扩增人干燥综合征B抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠埃希菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSB。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。重组质粒导入大肠埃希菌BL21,阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达。结果RT-PCR扩增产物为1245bp。重组质粒PET-30a-SSB经EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子量为73ku,具有天然SSB抗原活性。结论成功克隆SSB基因并表达融合蛋白。

摘要：目的克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-52kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSA-52kDcDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源Hela细胞总RNA作为模板,反转录RT-PCR扩增人干燥综合征SSA-52kD抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对DNA测序结果进行鉴定分析。结果RT-PCR扩增产物为1447bp。重组质粒PET-30a-SSA-52kD经BglⅡ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。结论成功克隆人SSA-52kD基因,并构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。

摘要：基因工程技术是一种按照人们的构思和设计 ,在体外操作遗传物质 ,并最终实现改造生物的新技术。基因工程技术通过人工操作基因 ,打破了生物种间以及动、植物间的遗传屏障 ,阐明了有关代谢、发育、调控及亚细胞结构方面的信息 ,在动、植物改良、化学工业、医疗卫生、生态环境、资源利用等方面都将引发新的革命。1　基因工程的定义所谓基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子 ,构成遗传物质的新组合并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内 ,而能持续稳定地繁殖的技术。或者说 ,基因工程是对ＤＮＡ(脱氧核酸 )大分子上的遗传单元 (基因 )进行体外操作 ,把不同来源的基因按照单元设计的蓝图 ,重新构成新的基因组合 (即重组体 ) ,再把它引入细胞中 ,构成具有新的遗传特性的生物。从实质上讲 ,基因工程的特征 ,第一个是它将外源ＤＮＡ的新组合引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种ＤＮＡ分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的 ,这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力 ,克服了固有的生物种间的限制 ,扩大和带来了定向创新生物的可能性 ,这是基因工程的最大特点。基因工程的第二个特征是 ,一种确定的ＤＮＡ小片断能够在...

摘要：目的:设计构建重组体为转染肿瘤细胞,观察癌基因的沉默效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法:以c-myc为靶基因,以pEGFP-C1/U6质粒为载体,设计构建重组体,根据c-myc癌基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pEGFP-C1/U6中,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。

摘要：无毒基因是病原物中决定寄主抗病性表达的功能基因,其功能的丧失导致毒性小种的产生。本研究利用随机引物扩增DNA多态性技术,从稻瘟病菌菌株S1522中新筛选到1个与无毒基因AVR-Pikm紧密连锁的DNA标记OPE121400。根据OPE121400的核苷酸序列,设计了1对含有17个核苷酸的特异性SCAR引物,并利用该引物对无毒表型亲本S1522和毒性表型亲本S159及其有性杂交后代的108个菌株进行了PCR扩增。结果表明:所有无毒表型的菌株均能特异性扩增出1条与OPE121400大小相近的DNA片段,而毒性表型的菌株除2个重组体外,均不能扩增出此片段。根据计算,这一SCAR标记与目标无毒基因AVR-Pikm之间的遗传距离为1.89 cM,与本研究小组先前报道的另一个标记OPO121000位于目标基因的同一侧,但与OPO121000相比,距目标基因近了2.86 cM。本标记的获得将有助于确定AVR-Pikm在染色体上的位置,有助于确定用于进一步筛选位于相反一侧的连锁标记的重叠群区域。

摘要：目的 :探讨pTRE顺式作用元件调控 ,EGFP标记hEPO(hEPO EGFP)融合蛋白设计的合理性。方法 :应用GeneConstructionKit2 5、www .expasy .com网站提供的分析方案 ,分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性 ,并作蛋白质二级结构模拟。结果 :重组体的转录受pTRE顺式作用元件调控 ,Linker所在部位柔性高 ,融合蛋白表达后 ,二级结构预测Linker不改变蛋白结构 ,完全符合作者设计EGFP标记hEPO融合蛋白的初衷。结论 :重组蛋白设计合理 ,融合蛋白有很大可能保留了hEPO和EGFP的理化特性 ,为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础。